產(chǎn)纖維素酶的篩選

一株產(chǎn)纖維素酶新菌株的篩選

及酶學(xué)性質(zhì)初步研究

主講人：何園學(xué)號(hào)：2014103015時(shí)間：2014.11.131.研究背景2.試驗(yàn)?zāi)康?.技術(shù)路線(xiàn)4.試驗(yàn)方法5.預(yù)期效果6.參考文獻(xiàn)講解內(nèi)容一.研究背景纖維素作為地球上最豐富的可再生有機(jī)資源，其轉(zhuǎn)化和利用對(duì)解決能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問(wèn)題具有十分重要的意義。纖維素酶是能夠作用于纖維素底物β-1,4葡萄糖苷鍵的一類(lèi)生物酶的總稱(chēng)。由于開(kāi)發(fā)利用木質(zhì)纖維資源對(duì)人類(lèi)社會(huì)的今后發(fā)展具有重大意義，而纖維素酶對(duì)纖維素資源的開(kāi)發(fā)起到極為關(guān)鍵的作用，對(duì)其研究一直是國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)。纖維素代謝也是地球生物圈碳素循環(huán)的重要組成部分，尋找和開(kāi)發(fā)高產(chǎn)纖維素酶菌種，是充分利用纖維素資源的關(guān)鍵。研究進(jìn)展：

該類(lèi)酶上世紀(jì)40年代首次被發(fā)現(xiàn)。早期發(fā)現(xiàn)的纖維素酶主要由絲狀真菌的木霉、根霉等菌種產(chǎn)生，通常為酸性酶其最適作用pH值在3-5，在堿性條件下基本沒(méi)有酶活或活力很低。上世紀(jì)70年代，在嗜堿性的枯草芽孢桿菌(Bacillussp.N-4和Bacillussp.1139菌株)中發(fā)現(xiàn)了最適作用pH在堿性范圍的纖維素酶，即堿性纖維素酶。隨后發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬(Bacillus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的數(shù)十株嗜堿性菌株均能夠產(chǎn)生堿性纖維素酶，此外，動(dòng)物源堿性纖維素酶開(kāi)始被報(bào)道，并成為開(kāi)發(fā)堿性纖維素酶的重要方向。二.試驗(yàn)?zāi)康哪壳?，酸性纖維素酶主要用于纖維素的水解糖化，而堿性纖維素酶則廣泛用于洗滌工業(yè)。不過(guò)，至今所研發(fā)的纖維素酶仍存在酶活力不足等問(wèn)題，有必要挖掘新的酶資源。三.技術(shù)路線(xiàn)產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩菌株形態(tài)觀察菌株分子鑒定誘變育種產(chǎn)高活性纖維素酶菌株的鑒定菌株生化鑒定優(yōu)化產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件制備酶液測(cè)定酶活力繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)和產(chǎn)酶曲線(xiàn)圖測(cè)定CMC酶的最適作用條件確定產(chǎn)纖維素酶菌株的屬種比較兩種菌株酶活力測(cè)其透明圈及酶活力四.試驗(yàn)方法1.材料和儀器(1).用于菌株分離的樣品采自畜禽堆肥。(2).所用培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、CMC-剛果紅平板篩選培

養(yǎng)基、CMC液體發(fā)酵培養(yǎng)基、Bug培養(yǎng)基(3).儀器:菌種鑒定96孔板2.方法

(1).菌株初篩：取樣品1g，加10mL無(wú)菌蒸餾水，充分振搖，靜止30min，取上清液稀釋105倍，涂布接種CMC-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72h至菌落長(zhǎng)出，挑取透明水解圈較大的菌落。(2).菌株復(fù)篩：挑取透明水解圈較大的菌落，接種CMC液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、200rpm搖瓶培養(yǎng)24h，測(cè)定培養(yǎng)液的堿性CMC酶活力，選取活力最高的培養(yǎng)瓶，取菌液劃線(xiàn)接種CMC-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，純化菌種３次，最后得到產(chǎn)堿性纖維素酶的高產(chǎn)菌株，命名，斜面和冷凍干燥保藏。(3).菌株的形態(tài)觀察：LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體用革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌株形態(tài)。(4).分子鑒定：提取菌體DNA(CTAB法)，以該基因組DNA為模板，采用通用引物27F/1492R，PCR擴(kuò)增菌株的16SrRNA序列。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、分離，然后用AgaroseGel

DNAPurificationKit試劑盒切膠回收，用T4ligase連接到Pmd-18T載體上。將帶有目的片段的載體通過(guò)轉(zhuǎn)化E.coliDH5α菌株擴(kuò)增培養(yǎng)后，選擇陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒測(cè)序。將測(cè)序得到的16SrRNA序列用NCBI的BLAST2.0進(jìn)行同源分析，搜索Genebank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定。(5).菌株生化鑒定:采用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行。操作按儀器的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(6).誘變育種：●制備孢子懸液：取試管斜面，用無(wú)菌水洗下孢子，裝入帶玻璃珠的三角瓶中，27℃振蕩2-3h，用脫脂棉過(guò)濾后，以10倍稀釋法作一系列稀釋?zhuān)暨x一個(gè)稀釋度，用移液管移lml飽子懸液到小塑料離心管中，待用?！褡贤?UV)誘變方法：距離紫外燈30cm左右照射60s、70s、80s、90s、100s，并不斷搖動(dòng)?！窳蛩岫阴?DES)誘變方法:分別吸取1ml孢子懸液10ulDES(終濃度為1%)和30ul乙醇溶液于一小塑料離心管中，于30℃水浴振蕩45min、60min、75min，處理完畢后加入30ul25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。●

UV-硫酸二乙酯(DES)復(fù)合誘變(7).測(cè)定誘變后菌株的透明圈并將其菌株發(fā)酵測(cè)其酶活力。(8).菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶特性測(cè)定:活化菌株接種CMC發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量5％，30℃、200rpm下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液的OD600和CMC酶活力，觀察菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)纖維素酶情況，繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)與產(chǎn)酶曲線(xiàn)圖。優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件，對(duì)3-12的pH值條件以及25-37℃溫度條件下菌株生長(zhǎng)也進(jìn)行觀察。(9).酶液制備:活化菌株接種CMC發(fā)酵培養(yǎng)基30℃、200rpm培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液，4℃，4000rpm離心10min，取上清，55%(NH4)2SO4溶液沉淀粗蛋白,4℃，10000rpm離心10min，收集沉淀，加入培養(yǎng)液同體積的pH值8.0，0.1mol/L的Tris-HCL緩沖液溶解，４℃保存，用于測(cè)定酶的活力，2d內(nèi)使用。(10).酶活力測(cè)定:以CMC鈉鹽為底物，測(cè)定CMC酶活力。酶反應(yīng)體系含粗酶液0.5mL，CMC鈉鹽1%(g/mL)，0.1mol/L的Tris-HCL(pH值為8.0)緩沖液2.0mL。50℃水浴反應(yīng)60min，立刻用DNS法測(cè)定CMC水解所釋放的葡萄糖量。以作用CMC鈉鹽底物1min釋放1mg葡萄糖所需的酶量定義為１個(gè)酶活力單位。(11).比較誘變菌株與原菌株的酶活力。(12).繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)與產(chǎn)酶曲線(xiàn)圖:以最適的pH,溫度條件培養(yǎng)產(chǎn)酶菌株，每隔4h取一次發(fā)酵液，測(cè)定OD600

值與纖維素酶活力，繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)與產(chǎn)酶曲線(xiàn)圖。(13).測(cè)定CMC酶的最適作用pH值，最適作用溫度以及熱穩(wěn)定性。五.預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果1.可以分離出一株產(chǎn)纖維素的菌株。2.鑒定出該菌株所屬的屬種。3.對(duì)該菌株所產(chǎn)的纖維素酶有一定的了解，繪制出產(chǎn)

酶曲線(xiàn)圖和菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)，用來(lái)指導(dǎo)發(fā)酵工業(yè)。4.用誘變后的菌株看能否提高產(chǎn)酶活性，以更好的生

產(chǎn)出纖維素酶。六.參考文獻(xiàn)[1].禤金彩,廖龍,龍寒,etal.一株產(chǎn)纖維素酶蠟樣芽孢桿菌

的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,45(6):984-988.[2].蘆志龍,張穗生,吳仁智,etal.產(chǎn)纖維素酶新菌株的篩選

及其產(chǎn)酶特性研究[J].廣西科學(xué),2014,21(1):22-27.[3].封曄,來(lái)航線(xiàn),鄭真.高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶

條件研