第11章離心技術

第十章離心分離技術基本原理和計算泳離心運動懸浮在離心管的液態(tài)非均相物質(zhì)與轉子同步勻速旋轉時，密度大的顆粒所受到的合力不足以提供圓周運動所需的向心力，就在徑向上與密度較小的介質(zhì)發(fā)生相對運動而逐漸遠離軸心，此過程稱為離心運動。2第11章離心技術線速度作圓周運動的質(zhì)點沿其切線方向的速度，又稱圓周速度。，單位：m/s(米/秒)。角速度表示質(zhì)點轉動的快慢程度。

單位：rad/s(弧度/秒)

3第11章離心技術轉速用每分鐘的轉數(shù)，表示轉動的快慢。n=1/t，單位：r/min角速度與轉速兩者的換算關系線速度與角速度之間的關系4第11章離心技術離心加速度與離心力以線速度表示牛頓第二定律

角速度表示

轉速表示此時質(zhì)點在某一徑向位置上獲得的離心力與轉速的平方成正比，與旋轉半徑成正比，與顆粒質(zhì)量成正比。所以在離心時：離心管要以旋轉中心對稱放置（r等）；對稱管平均密度要基本一致；轉軸扭曲斷裂。5第11章離心技術相對離心力

意義：衡量離心設備的離心程度的重要技術參數(shù)，用于離心機的分類。離心力習慣上以相對離心力和重力加速度g的乘積表示，體現(xiàn)為相對離心力是重力的若干倍。6第11章離心技術沉降速度

離心管中的懸浮顆粒受力：離心力；浮力；摩擦力。7第11章離心技術Fb—浮力Ff—摩擦力Fc—離心力σ—顆粒密度ρ—介質(zhì)密度ξ阻力系數(shù)ν—離心沉降速度

8第11章離心技術Re—雷諾準數(shù)u—液體黏度。

所以斯托克斯定律：平衡表達式變換為：9第11章離心技術沉降速度球形顆粒在離心力場中的斯托克斯沉降速度公式，v與顆粒直徑平方，顆粒與介質(zhì)密度之差，離心加速度成正比（角速度&半徑）。=0時，顆粒和介質(zhì)密度相等，無法實現(xiàn)離心分離，10第11章離心技術重力場中的沉降速度當離心加速度是自由重力加速度g的數(shù)萬甚至數(shù)十萬倍時，v可以遠遠超過自由沉降，即使是顆粒直徑極小，密度較低的生物組分也可在短時間內(nèi)實現(xiàn)分離純化。11第11章離心技術第二節(jié)離心設備及其用途

離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。12第11章離心技術非均相混合物固體顆粒的混合物懸浮液乳濁液顆粒間為氣體分隔由固體顆粒與液體構成由不互溶液體構成→過濾→離心分離→篩分、分級沉降13第11章離心技術根據(jù)轉速和用途分類離心機可分為工業(yè)用離心機和實驗用離心機。實驗用離心機又分為制備性離心機和分析性離心機，制備性離心機主要用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大，分析性離心機一般都帶有光學系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)，依據(jù)待測物質(zhì)在離心場中的行為（用離心機中的光學系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測），能推斷物質(zhì)的純度、形狀和相對分子質(zhì)量等。分析性離心機都是超速離心機。14第11章離心技術低速離心機:最大轉速6000rpm左右，最大相對離心力近6000×g，容量為幾十毫升至幾升，分離形式是固液沉降分離?？捎盟睫D頭，角度轉頭，其轉速不能嚴格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細胞等。這種離心機多用交流整流子電動機驅動，電機的碳刷易磨損，轉速是用電壓調(diào)壓器調(diào)節(jié)，起動電流大，速度升降不均勻，一般轉頭是置于一個硬質(zhì)鋼軸上，因此精確地平衡離心管及內(nèi)容物就極為重要，否則會損壞離心機。15第11章離心技術高速離心機：最大轉速為20000-25000rpm（r/min），最大相對離心力為89000×g，最大容量可達3升，分離形式也是固液沉降分離，通常配有各種角式轉頭、蕩平式轉頭、區(qū)帶轉頭、垂直轉頭和大容量連續(xù)流動式轉頭、一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉轉頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0-40oC，轉速、溫度和時間都可以嚴格準確地控制，并有指針或數(shù)字顯示。16第11章離心技術超速離心機：大于30×103r/min，最大離心力600,000g，有驅動和速度控制系統(tǒng)，溫度控制系統(tǒng)，真空系統(tǒng)（減少摩擦）。新式的有微處理機（按編定程序運轉，自動計算速度和時間）。有40多種不同容量和性能的轉頭給用戶選擇。離心容量由幾十毫升至2升，分離的形式是差速沉降分離和密度梯度區(qū)帶分離，離心管平衡允許的誤差要小于0.1克。

超速離心機的出現(xiàn)，使生物科學的研究領域有了新的擴展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細胞器得到分級分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。

17第11章離心技術冷凍離心機構造圖18第11章離心技術按結構分類一般在高速和低速離心機根據(jù)結構和功能進行分類，品種繁多，各廠家命名也無統(tǒng)一標準。可分為臺式離心機、多管微量臺式離心機、細胞涂片離心機、血液洗滌臺式離心機、高速冷凍離心機、大容量低速冷凍離心機、低速冷凍離心機、臺式高速冷凍離心機、臺式低速自動平衡離心機等。19第11章離心技術左上：普通臺式離心機。左下：冷凍臺式離心機。右：超速離心機。20第11章離心技術左圖：不同離心機的不同轉頭右圖：超速離心機的不同轉頭21第11章離心技術轉頭⑴角式轉頭角式轉頭是指離心管腔與轉軸成一定傾角的轉頭。它是由一塊完整的金屬制成的，其上有4-12個裝離心管用的機制孔穴，即離心管腔，孔穴的中心軸與旋轉軸之間的角度在20-40度之間，角度越大分離效果越好。22第11章離心技術⑵蕩平式轉頭、甩平轉子（Siwing-Bucket-Rotor）這種轉頭有4或6個自由活動的吊桶（離心套管），當轉頭靜止時，吊桶垂直懸掛，當轉頭轉速達到每分鐘200到800轉時，吊桶蕩至水平位置，這種轉頭最適合做密度梯度區(qū)帶離心23第11章離心技術（3）垂直轉頭其離心管垂直放置，樣品顆粒的沉降距離短，離心所需時間也短，適用于密度梯度區(qū)帶離心，離心開始時和結束時液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉向，因而降速要慢。24第11章離心技術離心管離心管主要用塑料和不銹鋼制成：塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學腐蝕。但用時也應避免接觸強腐蝕性的化學藥品，如強酸、強堿等。25第11章離心技術塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴，倒置不漏液。管蓋有三種作用：①防止樣品外泄。用于有放射性或強腐蝕性的樣品時，這點尤其重要。②防止樣品揮發(fā)。③支持離心管，防止離心管變形。

26第11章離心技術27第11章離心技術沉降系數(shù)單位離心加速度的沉降速度；，合并了；，單位秒（s），顆粒直徑d很小，所以s也很小，一般以10-13為一個基本單位，S表示，1S=10-13s。正、反、平衡點。沉降系數(shù)與物質(zhì)顆粒的大小、形狀、密度、介質(zhì)的密度黏度相關，對于給定的溫度和溶劑，s是微粒物質(zhì)的特性常數(shù)。第三節(jié)超離心技術——制備型超速離心28第11章離心技術11.3.1離心分離方法的選擇差速離心法：這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。29第11章離心技術差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當以一定的離心力在一定的離心時間內(nèi)進行離心時，在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉速下再進行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它成分，需經(jīng)過2-3次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。30第11章離心技術31第11章離心技術此法主要由于組織勻漿液中分離細胞器和病毒，其優(yōu)點是：操作簡易，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉子。缺點是：須多次離心，沉淀中有夾帶，分離效果差，不能一次得到純顆粒，沉淀于管底的顆粒受擠壓，容易變性失活。32第11章離心技術可用角式、水平式轉頭33第11章離心技術密度梯度離心：又稱速率區(qū)帶離心法。是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。34第11章離心技術離心后在近旋轉軸處（r1）的介質(zhì)密度最小，離旋轉軸最遠處（r2）介質(zhì)的密度最大，但樣品中粒子的最小密度必須大于最大介質(zhì)密度，即＞ρ。35第11章離心技術這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20%的沉降系數(shù)差或更大）或相對分子質(zhì)量相差3倍的蛋白質(zhì)。大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。36第11章離心技術離心管先裝在密度梯度介質(zhì)溶液，樣品液加在梯度介質(zhì)的液面上，離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶會越靠近離心管底。37第11章離心技術由＞ρ可知S＞0，因此該離心法的離心時間要嚴格控制，既有足夠的時間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達到離心管底之前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。離心必須在沉降最快的大顆粒到達管底前結束，樣品顆粒的密度要大于梯度介質(zhì)的密度。梯度介質(zhì)通常用蔗糖溶液，其最大密度和濃度可達1.28kg/cm3和60％。38第11章離心技術注意點：

①嚴格控制離心時間

②粒子密度大于介質(zhì)密度

③樣品事先配制在較平緩的連續(xù)密度的梯度溶液

④不能用角式轉頭、只能用水平式轉頭

此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是用于分離大小相異而密度相似的物質(zhì)。39第11章離心技術等密度離心：密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在預先制備好的梯度介質(zhì)溶液頂上，或先與梯度液混合后裝入離心管，離心開始后，當梯度液由于離心力的作用逐漸形成管底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。離心時，樣品的低密度的顆粒向上浮起，高密度的顆粒向下沉降，一直移動到與它們的密度相等的等密度點的特定梯度位置上，形成不同的區(qū)帶。40第11章離心技術當介質(zhì)的密度大于粒子的密度，即σ<ρ時粒子上??；在σ＞ρ時，則粒子沉降，最后粒子進入到一個與它本身的密度相等的位置，即σ=ρ，此時dx/dt為零，粒子不再移動，粒子形成純組份的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關，因此只要轉速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。41第11章離心技術①離心時間要長

②可用角式轉頭或水平式轉頭

③粒子密度相近或相等時不宜用

④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度

⑤不能用剎車42第11章離心技術等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl，其密度可達1.7g/cm3。此法可分離核酸、亞細胞器等，也可以分離復合蛋白質(zhì)，但簡單蛋白質(zhì)不適用。43第11章離心技術收集區(qū)帶的方法有許多種:

a:用注射器和滴管由離心管上部吸出。

b:用針刺穿離心管底部滴出。

c:用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。

d:用一根細管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動部分收集器收集。44第11章離心技術五、分析性超速離心與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結構，而不是專門收集某一特定組分。因此它使用了特殊的轉子和檢測手段，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程。45第11章離心技術分析性超速離心的工作原理：了解46第11章離心技術47第11章離心技術固定角式轉子48第11章離心技術49第11章離心技術Importantconsideration:SAFETY50第11章離心技術Balanceyourtubes,always!!51第11章離心技術Loadtubesevenly52第11章離心技術53第11章離心技術54第11章離心技術分析性超速離心的工作原理：11.3.2轉子與離心管的選擇55第11章離心技術11.3.3梯度溶液的制備梯度材料的選擇原則作為一種理想的梯度材料應具備以下幾點：①與被分離的生物材料不發(fā)生反應，即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。②可達到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。

56第11章離心技術③不會對離心設備發(fā)生腐蝕作用。④容易純化，價格便宜或容易回收。⑤濃度便于測定，如具有折光率。⑥對于超速離心分析工作來說，它的物理性質(zhì)、熱力學性質(zhì)應該是已知的。57第11章離心技術上述條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的?；旧戏仙鲜鲈瓌t的梯度材料有：

①糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達1.33g/ml，且由于價格低容易制備，是現(xiàn)在實驗室里常用于細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細胞的分離。58第11章離心技術聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400，也就是相對分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡萄糖胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細胞，包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。

59第11章離心技術②無機鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。氯化銫：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較高。鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。60第11章離心技術③有機碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。④硅溶膠：如Percoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP），滲透壓低，對生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下仍是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強度下不穩(wěn)定?？捎糜诩毎?、細胞器和病毒的分離。⑤蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機物：如氟代碳等。61第11章離心技術11.3.4離心操作的注意事項高速與超速離心機是生化實驗教學和生化科研的重要精密設備，因其轉速高，產(chǎn)生的離心力大，使用不當或缺乏定期的檢修和保養(yǎng)，都可能發(fā)生嚴重事故，因此使用離心機時都必須嚴格遵守操作規(guī)程。

62第11章離心技術超速冷凍離心機:未經(jīng)過培訓和考核者不能使用。其它普通離心機：按照操作要求進行。63第11章離心技術1.使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，平衡時重量之差不得超過各個離心機說明書上所規(guī)定的范圍，每個離心機不同的轉頭有各自的允許差值，轉頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當轉頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉頭中，以便使負載均勻地分布在轉頭的周圍。2.離心前必須仔細檢查轉頭各孔內(nèi)有無異物。3.若要在低于室溫的溫度下離心時。轉頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉頭室內(nèi)預冷。64第11章離心技術4.裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕，而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。每次使用后，必須仔細檢查轉頭，及時清洗、擦干，轉頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護，嚴禁使用顯著變形、損傷或老化的離心管。65第11章離心技術5.離心過程中不得隨意離開，應隨時觀察離心機上的儀表是否正常工作，如有異常的聲音應立即停機檢查，及時排除故障。6.每個轉頭各有其最高允許轉速和使用累積限時，使用轉頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉頭的最高使用限時，則須按規(guī)定降速使用。7.離心時不準開蓋，不準用手停止轉頭。66第11章離心技術低速大容量多管離心機操作程序與注意事項一、操作程序：

1.插上電源，待機指示燈亮：打開電源開關，調(diào)速與定時系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù)字為機器工作轉速的出廠設定。

2.設定機器的工作參數(shù)，如工作溫度，運轉時間，工作轉速等。

控制面板上的運轉鍵，離心機開始運轉。在預先設定的加速時間內(nèi)，其轉速升至預先設定的值。

在預先設定的運轉時間內(nèi)（不包括減速時間），離心機開始減速，其轉速在預先設定的減速時間內(nèi)降至零。

按控制面板上的停止鍵，數(shù)碼管顯示dedT，數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉速值，這時機器已準備好下一次工作。67第11章離心技術二、注意事項：除運轉速度和運轉時間外，不要隨意更改機器的工作參數(shù)，以免影響機器性能。轉速設定不得超過最高轉速，以保機器安全運轉。使用中如出現(xiàn)0.00或其它數(shù)字，機器不運轉，應關機斷電，10秒后重新開機，待所設定轉速顯示后，再按運轉鍵，機器將照常運轉。不得在機器運轉過程中或轉子未停穩(wěn)的情況下打開蓋門離心機必須等量灌注樣品，切不要使轉頭在不平衡狀況下運行。離心機一次最好不要超過60分鐘。離心機必須可靠接地；機器不使用，要拔掉電源插頭。68第11章離心技術高速冷凍離心機１．通常離心機使用都會有登記表，請在使用前正確登記（使用者、轉子、轉速、時間）。２．離心管一定要平衡好，放入轉子時也要注意位置平衡。絕對不要超過離心機或轉子的最高限轉速。３．一定要在達到預設轉速后，才能離開離心機；若有任何異狀，要立刻停機。４．通常聽聲音即可得知離心狀況是否正常，也可注意離心機的震動情形。５．使用硫酸銨等高鹽溶液樣本后，一定要把轉子洗干凈，也要清理離心艙。６．超高速離心機則因轉速極高，也更加復雜，需要另外的專門訓練才可使用。69第11章離心技術使用步驟：

通常使用離心機前都要登記，請養(yǎng)成登記習慣。１．設定使用溫度(通常為４℃)后，先把轉子放入離心艙中，注意轉子要卡好軸心；關上艙門，離心艙的溫度開始下降，預冷時間要充足。70第11章離心技術２．把樣本裝入適當?shù)碾x心管，雙雙用天平平衡重量，蓋上離心管蓋子并旋緊。71第11章離心技術◆注意離心管只裝七成滿，雖然加有蓋子，但也可能因離心力太強而外泄。