細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)

研究生實(shí)驗(yàn)技能培訓(xùn)講座

－－細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)

實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心侯孟君基本概念細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞系細(xì)胞株原代培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)技術(shù)

即是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。細(xì)胞系

培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞有限細(xì)胞系（FiniteCellLine）連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（InfiniteCellLine）腫瘤細(xì)胞系或株

我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞具有不死性和異體接種致瘤性。

細(xì)胞株用單細(xì)胞分離培養(yǎng)增殖形成的具特定生長特性的細(xì)胞群再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株。細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名以供體患者的姓名命名：

HeLa（來源于宮頸癌）

以時(shí)間地點(diǎn)來命名：

CHO中國倉鼠卵巢細(xì)胞（ChineseHamsterOvary，）宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstituteofHealth）建立每3天傳代，每次接種3×105細(xì)胞／ml以組織來源命名：如BHK(幼地鼠腎細(xì)胞)

以臨床疾病類型命名：如BALL-1細(xì)胞系(來自B淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞)

原代培養(yǎng)

直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行的第一次培養(yǎng)物。優(yōu)點(diǎn)：組織細(xì)胞剛脫離機(jī)體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。

大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)

1.細(xì)胞種類：大鼠原代肝細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：剛分離，未經(jīng)培養(yǎng)；

細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：剛分離時(shí)球形透亮，貼壁后呈不規(guī)則。傳代將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長、繁殖一定時(shí)間后，由于空間不足或細(xì)胞密度過大導(dǎo)致營養(yǎng)枯竭，會(huì)影響細(xì)胞的生長，因此需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。

HepG2細(xì)胞

細(xì)胞種類：人肝腫瘤細(xì)胞；

培養(yǎng)的天數(shù)：傳代培養(yǎng)2天；

細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：呈多角型、不規(guī)則貼壁生長，成團(tuán)聚集。

傳代注意事項(xiàng)接種數(shù)量為5×104～8×105個(gè)/ml傳代密度太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到增長前有較長的滯留期。培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長滿培養(yǎng)瓶表面，即可進(jìn)行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件無菌條件細(xì)胞生長條件細(xì)胞檢測條件細(xì)胞保存條件實(shí)驗(yàn)室安全細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。（使用前）紫外照射（1小時(shí)）每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒生物安全柜

使用前開啟柜內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘，預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)。使用完畢后，要用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈。還要定期用福爾馬林熏蒸。常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒

玻璃器皿的清洗一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟新的橡膠制品洗滌方法0.5MNaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5MHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。

消毒前包裝常用的包裝材料牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、鋁箔火焰消毒在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。培養(yǎng)瓶滴管、試管、吸管細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)用品

細(xì)胞培養(yǎng)瓶

25平方厘米，正方斜頸25平方厘米，三角斜頸75平方厘米，正方斜頸75平方厘米，三角斜頸150平方厘米，正方斜頸

細(xì)胞培養(yǎng)板

6孔，12孔，24孔，48孔96孔

細(xì)胞培養(yǎng)皿

35mm

60mm

100mm

凍存管

1.2ml2ml，5ml離心管

15ml

50ml細(xì)胞刮濾器大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。液氮罐何處購買細(xì)胞ATCC細(xì)胞庫().美國菌種保藏中心又稱美國模式菌種收集中心(ATCC)是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的，非贏利性組織。目前它可以提供以下物品

細(xì)胞系3000種細(xì)菌和噬菌體15000種動(dòng)植物病毒2500種原生動(dòng)物1200種以及重組物品歐洲動(dòng)物細(xì)胞庫(ECACC)和日本細(xì)胞庫(RCB)

國內(nèi)細(xì)胞庫中國科學(xué)院細(xì)胞庫中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心

聯(lián)系方法：

地址：上海市岳陽路320號(hào)，200031

電話54920405

Fax/p>

聯(lián)系人：陳松華，徐惠均

e-mail:shchen@

/cctcc/fzlbc/pywml.htm中國典型培養(yǎng)物保藏中心也稱武漢大學(xué)保藏中心，是國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的專利培養(yǎng)物/生物材料／菌種保藏機(jī)構(gòu)

訂購程序向中心訂購培養(yǎng)物，可查閱CCTCC培養(yǎng)物目錄，并向CCTCC提出訂購培養(yǎng)物的名稱、CCTCC保藏號(hào)等內(nèi)容。聯(lián)系方式可通過電話、傳真，信函，電子郵件等方式。電話真-mail:cctcc@細(xì)胞系：300～500元/每株菌種準(zhǔn)備時(shí)間

一般情況CCTCC收到訂購人的匯款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。

細(xì)胞的營養(yǎng)碳水化合物、氨基酸和脂類三大類也需要一定量的無機(jī)鹽、維生素和微量元素細(xì)胞培養(yǎng)液

水平衡鹽溶液pH調(diào)節(jié)液消化液抗生素溶液培養(yǎng)基水：新鮮配置的三蒸水或去離子水桶裝水：怡寶細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制平衡鹽溶液主要由無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成作用維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度常用的緩沖液生理鹽水PBSHanks液

（D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液）pH調(diào)節(jié)液(1)碳酸氫鈉液(2)Hepes緩沖液是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值較長時(shí)間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑通常使用濃度為10～15mM消化液胰蛋白酶溶液主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開來常用濃度為0.25%或5%胰蛋白酶。(2)EDTA溶液作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可用EDTA和胰酶的混合液

EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶(3)膠原酶溶液膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷?？股厝芤和ǔＪ乔嗝顾睾玩溍顾芈?lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對(duì)革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。

培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位

培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：血清血漿組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）

合成培養(yǎng)基

根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。包括四大類物質(zhì)：無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物目前常用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、另有無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基RPMI1640最初是由G，E，Moore為培養(yǎng)小鼠白血病細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。開始的配方特別適合于懸浮細(xì)胞生長，主要是針對(duì)淋巴細(xì)胞，后經(jīng)過改良，從RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。其組分較為簡單，適合許多種細(xì)胞生長，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。尤其適合人白細(xì)胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、K-562及KATO—III等細(xì)胞系的培養(yǎng)。

RPMI1640種類RPMI—1640（A）（不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）RPMI—1640（A）無酚紅（不含谷氨酰胺、高壓滅菌）RPMI—1640（含谷氨酰胺、除菌過濾滅菌）

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基

是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的與MEM比較增加了各種成分用量，同時(shí)又分為高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長，適于生長較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等。

DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】

DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過濾滅菌】

DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過濾滅菌】。

干粉培養(yǎng)基的配制

認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。血清的使用血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵常用血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）56℃，30分鐘。血清的消毒過濾除菌。牛血清胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛小牛血清取自出生10－30天的小牛使用濃度：一般為5－20％，最常用是10％

何謂FBS、FCS、CS、HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清HS(horseserum)則是指馬血清

血清解凍步驟逐步解凍法–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。勿直接由–20℃至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

無機(jī)鹽CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。氨基酸

纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成谷氨酰胺具有特殊的作用，補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。休息一會(huì)兒吧！伸伸腿，彎彎腰！體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

貼附型大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：成纖維細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型多型細(xì)胞型1、成纖維細(xì)胞型

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長短不等的突起，中有卵圓形核生長特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起成纖維細(xì)胞

HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：4d；原代培養(yǎng)；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+15％胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞呈梭形，扁平形或多角形，貼壁生長。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代；

2.培養(yǎng)天數(shù)：7天；

3.放大倍數(shù)：200倍，倒置顯微鏡；

4.培養(yǎng)基種類：DF12+10％FBS；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：使用percoll密度梯度離心法分離人骨髓細(xì)胞。首次換液48h，這是7天后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增情況。

2、上皮型細(xì)胞名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核生長特點(diǎn)：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀

生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)上皮型細(xì)胞SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）

1.細(xì)胞種類：SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后3d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+5%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞貼壁生長，生長速度較快。

CCL-149

1.細(xì)胞種類：大鼠肺泡上皮細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：1d（種在48孔板中）；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：F12K+10%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞呈梭形，透亮貼壁生長，3－4天傳代一次，Giemsa染色。

3、游走細(xì)胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。

CNE1

1.細(xì)胞種類：高分化鼻咽癌細(xì)胞系；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：3d；

3.放大倍速：相差100；

4.培養(yǎng)基種類：PMI1640+10%CS；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細(xì)胞，梭型成團(tuán)生長。4、多型細(xì)胞型有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

SD大鼠神經(jīng)元原代

1.細(xì)胞種類：腦皮質(zhì)細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：4-5天；

3.放大倍速：電鏡20000；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清+10%馬血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細(xì)胞，有多量軸突和樹突。

懸浮型概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn)：在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，

易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞)HL-60分化細(xì)胞Giemsa染色1.細(xì)胞種類：HL-60；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：ATRA1微摩爾作用5天；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：1640+8％胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：懸浮細(xì)胞，分化的細(xì)胞核漿比例減小，核仁減少或消失，胞核呈桿狀或分葉狀。

KU812

1.細(xì)胞種類：人嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：5d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞呈圓形，懸浮生長。

HeLa細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：人HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：7d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X200；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞呈多角形，貼壁生長。

K562細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：K562（人慢性紅白血病細(xì)胞株）；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后2天；

3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%胎牛血清，4mMGlutamine；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡介：懸浮生長，少數(shù)貼壁，喜愛成團(tuán)懸浮。

每代貼壁細(xì)胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長期停止期（平臺(tái)期）游離期

懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。吸附期

貼附底物，一般24小時(shí)內(nèi)貼壁。潛伏期

此時(shí)細(xì)胞有生長活動(dòng)，基本無增殖。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長期

細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）

細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)，傳代方法有3種：1．懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。2．半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3．貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細(xì)胞傳代方法首次傳代注意事項(xiàng)細(xì)胞生長密度不高時(shí)，不能急于傳代原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些小牛血清濃度可加大至15%～20%左右

細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞Coulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×104

注意：壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。培養(yǎng)細(xì)胞活力測定細(xì)胞活力：總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。測定方法臺(tái)盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。流式細(xì)胞儀

細(xì)胞活性指標(biāo)通常包括細(xì)胞膜對(duì)核酸染料的通透性，代謝活性，膜電位等。

3．四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；MTT比色法的原理：

活細(xì)胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臢（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標(biāo)儀測定OD值；細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下