FISH痰脫落細(xì)胞檢查診斷肺癌的價值

FISH痰脫落細(xì)胞檢查診斷肺癌的價值

摘要：目的探討熒光原位雜交技術(shù)(FISH)痰脫落細(xì)胞檢測診斷肺癌的價值。

方法分別采用FISH、常規(guī)痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查(常規(guī)方法)檢測60例疑似肺癌患者3、7、17染色體和9號染色體p16位點(diǎn)異常，以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，分析FISH、常規(guī)方法及二者聯(lián)合檢測診斷肺癌的敏感度和特異度。

結(jié)果病理診斷為肺癌43例，肺良性病變17例。FISH與常規(guī)方法診斷肺癌的敏感性分別為65.1％、32.5％，P=0.003；特異性分別為76.5％、100％，P=l；常規(guī)方法+FISH聯(lián)合檢測的敏感性與特異性分別為72.1％、100％，與常規(guī)方法相比，P分別=0、l。FISH與常規(guī)方法檢測對TNM分期為I~Ⅱ期的敏感性分別為55.6％、22.2％，P=0.040；Ⅲ~IV期的敏感性分別為72％、40％，P=0.025；常規(guī)方法+FISH聯(lián)合對TNM分期為I~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期的敏感性分別為66.7％、76％，與常規(guī)方法相比，P分別=0.007、0.010。FISH、常規(guī)方法及二者聯(lián)合檢測對肺癌分期的診斷特異性無統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié)論

FISH診斷肺癌的敏感性明顯高于常規(guī)方法，與常規(guī)方法聯(lián)合檢測可顯著提高痰液標(biāo)本診斷肺癌的準(zhǔn)確性。

胸片、CT及痰細(xì)胞學(xué)檢查為目前肺癌早期的主要篩查手段，但特異性及敏感性均較低，早期漏診率高；而大部分肺癌患者就診時病情已發(fā)展到晚期，病死率高。熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，其可迅速檢測出中期分裂相／間期核細(xì)胞中染色體數(shù)目等異常變化，為肺癌的遺傳學(xué)研究提供了新方法。本文就采用雙色FISH技術(shù)檢測了60例初診疑似肺癌患者痰液中脫落細(xì)胞3、7、17染色體和9號染色體P16位點(diǎn)異常情況，并以組織病理確診為肺癌金標(biāo)準(zhǔn)，探討FISH技術(shù)在肺癌診斷中的應(yīng)用價值。1.資料與方法1.1臨床資料

60例初診疑似肺癌患者，男42例，女18例；年齡46—76歲，中位年齡63歲。長期吸煙35例，有慢性咳嗽咳痰病史47例。經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)檢查診斷證實(shí)為肺癌43例(肺癌組)，其中鱗癌26例、小細(xì)胞肺癌6例、腺癌11例；TNM分期I一Ⅱ期(早期)18例，Ⅲ～Ⅳ期(晚期)25例。肺良性病變17例(良性組)，其中結(jié)核10例，肺炎7例。另選取同期20例體檢健康者為對照組，年齡4l一80歲，中位年齡61歲。1.2痰脫落細(xì)胞檢查收集三組新鮮痰液標(biāo)本(取清晨漱口后深部第2、3口痰，連續(xù)3d，留置于無菌瓶中)，每例收集約20mL，分為兩等分各10mL，分別用于FISH檢測和常規(guī)痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查(常規(guī)方法)。1.2.1FISH檢測

標(biāo)本處理

1)將10ml痰液放入5~10ml消化液中，搖勻，靜置，去上清，離心，留取細(xì)胞沉淀

2)加入預(yù)熱的膠原酶B，吹打，水浴，離心，去上清，再加入預(yù)熱的0.075mol\L的KCL低滲液

3)放入37℃水浴箱低滲30分鐘

4)取出后加入新鮮固定液5ml，混勻，靜置，離心，去上清

5)緩慢加入5ml固定液，靜置10分鐘后離心

6)去除上清液加固定液離心（重復(fù)2~3次直到細(xì)胞成分洗干凈為止）玻片制備

1)滴制備好的細(xì)胞樣本到載玻片上（用顯微鏡觀察細(xì)胞分布情況）

2)（胃蛋白酶工作液）在2×SSC（pH7.0）液中浸泡2分鐘

3)依次在70%、85%、100%的乙醇中浸泡2分鐘，脫水1.2.2對照組痰脫落細(xì)胞染色體數(shù)目畸變的閾值(畸變率)

對采集的20例正常人痰液每組探針組合分析100個細(xì)胞。統(tǒng)計出現(xiàn)不同異常情況的百分比，閾值=平均數(shù)(M)+3×標(biāo)準(zhǔn)差(sD)，3、7、17號染色體探針各需要建立2個閾值(1個點(diǎn)、≥3個點(diǎn))，9p16探針需要建立3個閾值(0、1、≥3個點(diǎn))。任意≥2個位點(diǎn)出現(xiàn)異常(3號和17號染色體出現(xiàn)非整倍增加)可判斷為陽性；一個位點(diǎn)有≥2種異常(9p16有0信號點(diǎn)異常和3信號點(diǎn)異常)也可判斷為陽性。

若只有一個位點(diǎn)出現(xiàn)一種異常，擴(kuò)大計數(shù)細(xì)胞后再重新判斷。統(tǒng)計信號種類及與之相對應(yīng)細(xì)胞數(shù)目百分比并錄入圖像分析儀。在鏡下觀察雜交效果，以細(xì)胞雜交率>80％為有效標(biāo)本。細(xì)胞核膜須完整，在細(xì)胞核內(nèi)可見清晰明亮的橘紅色或黃綠色熒光信號，如出現(xiàn)2個或3個熒光點(diǎn)，兩個位點(diǎn)之間距離大于單個信號的直徑以上，且熒光強(qiáng)度相近，計為含有2條或3條染色體。如果兩個信號之間的距離<1個信號的直徑則計數(shù)為1條染色體。

正常表現(xiàn)：3(紅),7(綠)染色體著絲粒正常表現(xiàn)：P16(紅)位點(diǎn),17染色體著絲粒(綠)異常表現(xiàn)：出現(xiàn)染色體非整倍體異常表現(xiàn)：P16(紅)缺失，出現(xiàn)染色體非整倍體疑似肺癌患者染色體畸變

20例正常人痰脫落細(xì)胞染色體數(shù)目畸變的閾值(畸變率)為標(biāo)準(zhǔn)，判定疑似肺癌患者染色體畸變數(shù)。每組探針均組合分析100個細(xì)胞，計算異常率，判斷陽性個數(shù)。2結(jié)果

20例正常人痰脫落細(xì)胞染色體數(shù)目畸變的閾值(畸變率)見表1。2.2診斷價值

FISH與常規(guī)方法診斷的敏感性分別為65.1％(28/43)、32.5％(14/43)，P=0.003；特異性分別為76.5％(13/17)、100％(17/17)，P=1；聯(lián)合檢測的敏感性與特異性分別為72.1％(31/43)、100％(17/17)，與常規(guī)方法比較，P分別=0、1。FISH、常規(guī)方法判斷TNM分期為I～Ⅱ期的敏感性分別為55.6％(10/18)、22.2％(4/18)，P=0.040；Ⅲ～Ⅳ期敏感性分別為72％(18/25)、40％(10/25)，P=0.025；聯(lián)合檢測判斷I～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的敏感性分別為66.7％(12/18)、76％(19/25)，與常規(guī)方法比較，P分別=0.007、0.010；三種方法判斷不同分期患者的特異性無統(tǒng)計學(xué)差異。3討論

FISH是一種細(xì)胞遺傳學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的新技術(shù)，其采用熒光素直接標(biāo)記遺傳物質(zhì)DNA制備探針，與染色體或?qū)嶓w腫瘤及脫落細(xì)胞間期核進(jìn)行雜交，通過熒光顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞內(nèi)有無染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變；可直接用于檢測肺癌患者脫落細(xì)胞間期核染色體變化。已有相關(guān)文獻(xiàn)報道，利用支氣管鏡檢刷取標(biāo)本進(jìn)行FISH檢測可明顯提高早期肺癌檢出的敏感性，但支氣管鏡具有一定創(chuàng)傷性。用FISH技術(shù)對痰標(biāo)本進(jìn)行肺癌高危人群篩查，對肺癌的發(fā)生進(jìn)行早期干預(yù)是目前研究的熱點(diǎn)。近年來國內(nèi)外關(guān)于FISH檢測痰脫落細(xì)胞診斷肺癌的報道較少，且結(jié)論差異較大。

本研究FISH結(jié)果顯示，3，7，17號染色體和9號染色體p16在肺癌組與良性組均發(fā)生一定數(shù)目的畸變，說明染色體畸變在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ISH聯(lián)合常規(guī)方法檢測診斷肺癌的敏感性為72.1％，明顯高于常規(guī)方法，但特異性無統(tǒng)計學(xué)差異。有關(guān)報道，通過支氣管鏡檢查疑似肺癌患者得到刷檢樣本，F(xiàn)ISH及聯(lián)合方法診斷肺癌的敏