分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用課件

分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科曾釗宇

狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術(shù)，是通過對DNA或RNA的檢測來實(shí)現(xiàn)對疾病的檢測和診斷。但是，隨著第一張人類基因組測序圖的完成，以及由此而帶來的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝物組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展，分子診斷的內(nèi)涵已經(jīng)從單純的DNA/RNA拷貝、突變等變化的檢測，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測，并廣泛應(yīng)用于疾病的篩查、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后與預(yù)防等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。一、分子診斷的概念根據(jù)分子診斷技術(shù)特征劃分為三類：一、基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補(bǔ)的原則下形成異質(zhì)雙鏈?zhǔn)沁z傳物質(zhì)最重要的化學(xué)特征，這一過程亦被稱為分子雜交。分子雜交是所有分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，從最初的印跡雜交到聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術(shù)，都離不開堿基互補(bǔ)的分子雜交反應(yīng)。二、基于測序技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)DNA的序列分析是分子診斷學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)，各種遺傳疾病，病毒或細(xì)菌的感染與變異，在基因表達(dá)水平上的個(gè)性化用藥，多基因疾病的診斷與預(yù)測，最終都可以借助基因測序平臺的應(yīng)用。三、基于擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerasechainreaction，PCR），使體外擴(kuò)增DNA成為可能，開啟了體外擴(kuò)增和操作DNA或RNA技術(shù)的發(fā)展。到現(xiàn)在，擴(kuò)增DNA的技術(shù)已經(jīng)成為分子診斷應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，并發(fā)展變化了數(shù)十種核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。

PCR技術(shù)能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。二、PCR概述九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測PCR發(fā)展簡史1983

Mullis于12月16日成功發(fā)明了PCR1985關(guān)于PCR的文章首次由Mullis及其同事等人在《Science》雜志上發(fā)表198912月《Science》雜志將PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。199310月13日Mullis獲諾貝爾化學(xué)獎

1995熒光定量PCR技術(shù)出現(xiàn)PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇二、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性

退火

延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復(fù)PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系高靈敏度高特異性簡便快捷高效擴(kuò)增、忠實(shí)復(fù)制！PCR反應(yīng)的特點(diǎn)常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法及不足1.痰涂片作抗酸染色：陽性率低、費(fèi)時(shí)2.細(xì)胞培養(yǎng)“金標(biāo)準(zhǔn)”：周期太長(4-8W)3.血清學(xué)診斷：

a.接種BCG可出現(xiàn)陽性

b.不能區(qū)分活動性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人

c.交叉反應(yīng)，假陽性不能早期診斷！容易漏診、誤診！熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義1.能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA，靈敏度高，特異性強(qiáng)2.早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結(jié)核血液——播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病腦脊液——中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病宮頸拭子、尿道拭子——泌尿生殖道結(jié)核病二腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測：1、包括癌基因、抗癌基因2、腫瘤轉(zhuǎn)移基因3、轉(zhuǎn)移抑制基因三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用三遺傳病1、等位基因檢測2、多基因遺傳病的突變檢測3、基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用四其它應(yīng)用1.法醫(yī)學(xué)鑒定2.抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)3.縮短診斷的窗口期三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用窗口期：所謂“窗口期”,是指從感染病原體開始,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原體存在為止的這一段時(shí)間。美國90％以上輸血傳播HIV和HBV以及75％以上輸血HCV的危險(xiǎn)性均來自“窗口期”感染獻(xiàn)血。

提供直接證據(jù)縮短“窗口期”PCR檢測的臨床意義RNA+Ab-P24+Ab-血清陽轉(zhuǎn)后的方法RNAp24Ab血清陽轉(zhuǎn)抗體檢測臨界值

特異性抗體比例時(shí)間反應(yīng)指標(biāo)感染

血清陽轉(zhuǎn)前的方法怎樣檢測HIV早期感染?四、PCR檢測的標(biāo)本采集要求

實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)（SAT）實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)（SAT）是將核酸恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。國內(nèi)公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研發(fā)，擁有一整套自主知識產(chǎn)權(quán)和核心技術(shù)。（SAT）技術(shù)原理：

同一溫度下（42℃），以RNA為起始模板，通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)（100～1000個(gè)）RNA拷貝；每一個(gè)RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況。SAT檢測技術(shù)的優(yōu)勢：檢測靶標(biāo)：RNA靈敏度高，特異性強(qiáng)，易鑒別死菌、活菌，適合臨床判愈;擴(kuò)增產(chǎn)物：RNA高效擴(kuò)增，低污染;核酸提取：磁珠法提取純度高結(jié)果準(zhǔn)確;檢測方法：實(shí)時(shí)熒光檢測，擴(kuò)增、檢測同時(shí)進(jìn)行全程監(jiān)控;擴(kuò)增方式：42℃恒溫?zé)o需熱循環(huán)，設(shè)備成本低。總結(jié)

分子診斷技術(shù)經(jīng)歷近30年的快速發(fā)展，已經(jīng)形成了主要以雜交、測序和擴(kuò)增三種反應(yīng)模式為主的測試技術(shù)群，并且在臨床診斷中獲得了廣泛的應(yīng)用。原位雜交為主的技術(shù)對于檢測基因表達(dá)異常的遺傳性疾病具有明顯的優(yōu)勢，已成為細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室最有力的檢測工具之一。而全基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，使得高通量的測序方式來檢測全基因的表達(dá)差異或突變檢測的成本均大大降低，而且測試速度將逐漸適合臨床的需求，因此對于大量基因的表達(dá)和突變檢測，高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢將會越趨明顯。另一方面，RT-PCR、STA等PCR技術(shù)對于感染性疾病、低突變位點(diǎn)或變異的檢測，在成本上明顯優(yōu)于前兩者，因此PCR技術(shù)可能在臨床上擁有更好的應(yīng)用空間。不同的技術(shù)平臺有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，我們要針對不同的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本對象及需求,選擇適合的技術(shù)方法，力求在“高效,高質(zhì)量,低成本”這三者間找到合適的平衡點(diǎn)。

分子診斷學(xué)的快速發(fā)展，得益與分子診斷技術(shù)的日新月異。1990年啟動的人