標(biāo)準(zhǔn) DB37T 3690.1-2019 液體菌種制備技術(shù)規(guī)程 第1部分：香菇規(guī)范

1、ICS FORMTEXT 65.020.20 FORMTEXT B 05 FORMTEXT DB FORMTEXT 37DB FORMTEXT 37/T 3690.12019 FORMTEXT FORMTEXT 液體菌種制備技術(shù)規(guī)程第1部分：香菇 FORMTEXT Technical specifications for the preparation of liquid spawnpart1：Lentinula edodes2019 - 09 - 20發(fā)布2019 - 10 - 20實施 FORMTEXT 山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB37/T 3690.12019 HYPERLINK l _

2、Toc8127526 前言 PAGEREF _Toc8127526 h II HYPERLINK l _Toc8127527 1 范圍 PAGEREF _Toc8127527 h 1 HYPERLINK l _Toc8127528 2 規(guī)范性引用文件 PAGEREF _Toc8127528 h 1 HYPERLINK l _Toc8127529 3 術(shù)語和定義 PAGEREF _Toc8127529 h 1 HYPERLINK l _Toc8127545 4 基本要求 PAGEREF _Toc8127545 h 3 HYPERLINK l _Toc8127546 4.1 人員要求 PAGERE

3、F _Toc8127546 h 3 HYPERLINK l _Toc8127547 4.2 產(chǎn)地環(huán)境要求 PAGEREF _Toc8127547 h 3 HYPERLINK l _Toc8127548 4.3 生產(chǎn)設(shè)備與設(shè)施 PAGEREF _Toc8127548 h 3 HYPERLINK l _Toc8127549 5 生產(chǎn)技術(shù) PAGEREF _Toc8127549 h 3 HYPERLINK l _Toc8127550 5.1 工藝流程 PAGEREF _Toc8127550 h 3 HYPERLINK l _Toc8127551 5.2 品種選擇 PAGEREF _Toc812755

4、1 h 4 HYPERLINK l _Toc8127552 5.3 母種活化 PAGEREF _Toc8127552 h 4 HYPERLINK l _Toc8127553 5.4 搖瓶液體菌種生產(chǎn) PAGEREF _Toc8127553 h 4 HYPERLINK l _Toc8127554 5.5 發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn) PAGEREF _Toc8127554 h 5 HYPERLINK l _Toc8127555 5.6 貯藏 PAGEREF _Toc8127555 h 6 HYPERLINK l _Toc8127556 6 生產(chǎn)檔案 PAGEREF _Toc8127556 h 7 HYPE

5、RLINK l _Toc8127557 附錄A （規(guī)范性附錄） 香菇液體菌種生產(chǎn)記錄事項 PAGEREF _Toc8127557 h 8前言本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并組織實施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站、泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、山東七河生物科技股份有限公司、山東惠民齊發(fā)果蔬有限責(zé)任公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙淑芳、高瑞杰、高中強(qiáng)、王慶武、高霞、司元明、張燕、崔慧、吳元元、崔曉、張曉雱、王曉婷、林雪、崔艷秋、李霄、黃雪、蘇建昌、孫振福、張振宇、李欣。液體菌種制備技術(shù)規(guī)程第1部分：香菇范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)

6、定了香菇液體菌種的術(shù)語和定義、基本要求、生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)檔案管理等要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于香菇液體菌種的制備。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 150壓力容器GB/T 4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗染色法、培養(yǎng)基和試劑GB 5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T 12728食用菌術(shù)語GB 19170香菇菌種GB 50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范NY/T 528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程術(shù)語和定義GB/T 12728界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。食用菌液體菌種發(fā)酵

7、罐edible mushroom liquid strain fermenter進(jìn)行食用菌液體菌種培養(yǎng)的專用發(fā)酵設(shè)備，應(yīng)符合GB 150要求。食用菌液體菌種接種器edible mushroom liquid strain inoculator將液體菌種按無菌操作要求接種到固體培養(yǎng)基物料上的工具?？諝鈮嚎s機(jī)air compressor能為食用菌液體菌種發(fā)酵生產(chǎn)提供壓縮空氣的設(shè)備?？諝膺^濾器air filter能對食用菌液體菌種發(fā)酵罐所用空氣進(jìn)行濾除雜菌和其他雜質(zhì)，達(dá)到無菌潔凈要求的設(shè)備。罐壓jar pressure在液體菌種發(fā)酵制備過程中發(fā)酵罐內(nèi)保持的空氣壓力（表壓），單位：MPa。通氣量ven

8、tilation volume液體菌種培養(yǎng)過程中發(fā)酵罐體積與每分鐘通入發(fā)酵罐中無菌空氣體積的比例。用 V/V（發(fā)酵罐體積/通入空氣體積）表示。接種量inoculation amount菌種體積與培養(yǎng)基體積的比例，用百分?jǐn)?shù)表示。液體菌種菌齡period of liquid strain running菌種接入培養(yǎng)基開始計算的液體菌種培養(yǎng)時間。發(fā)酵罐空消empty fermenter sterilization對尚未加水投料的空發(fā)酵罐進(jìn)行高壓滅菌。投料feeding將配置好的培養(yǎng)基投放到培養(yǎng)器中。定容constant volume培養(yǎng)器中加入培養(yǎng)基后，加水至所要求體積發(fā)酵罐實消fermenter

9、sterilization指對投料后的發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。罐壓回零jar pressure returning to zero液體菌種培養(yǎng)過程中，發(fā)酵罐內(nèi)壓力回到零點。搖瓶液體菌種liquid spawn in flask裝至玻璃菌種瓶內(nèi)在磁力攪拌器或恒溫?fù)u床上培養(yǎng)的液體菌種。培養(yǎng)基起始pHinitial pH value of medium液體培養(yǎng)基滅菌后尚未接種時的pH?；疽笕藛T要求工作人員應(yīng)該保持個人衛(wèi)生，進(jìn)液體菌種發(fā)酵車間必須穿戴經(jīng)滅菌處理的工作服、口罩、鞋、帽。產(chǎn)地環(huán)境要求場所要求生產(chǎn)場所符合NY/T 528的環(huán)境衛(wèi)生要求，場地開闊、路面硬化、衛(wèi)生清潔。廠房要求廠房設(shè)計應(yīng)符合

10、 NY/T 528 要求，增設(shè)搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室。應(yīng)設(shè)置與職工人數(shù)相適應(yīng)的更衣室，車間入口處應(yīng)設(shè)置洗手、消毒和干手設(shè)施。過道應(yīng)設(shè)置風(fēng)淋室。車間地面應(yīng)能防水、防腐蝕、防滲漏、防滑，易清洗，有適當(dāng)?shù)呐潘露龋?.01.5）和良好的排水系統(tǒng)。墻壁和天花板應(yīng)能防潮、防霉、防水。門窗應(yīng)設(shè)置防蚊蠅紗網(wǎng)。車間安裝排氣管道或者排風(fēng)設(shè)備。液體菌種接種間應(yīng)設(shè)置緩沖間。搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室應(yīng)符合 GB 50073要求。車間設(shè)封閉式廢物桶。生產(chǎn)設(shè)備與設(shè)施生產(chǎn)設(shè)備與用具應(yīng)具有磅秤、天平、高壓蒸汽滅菌鍋、發(fā)酵罐、液體菌種接種器、超凈工作臺、調(diào)溫設(shè)備、除濕設(shè)備、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床或磁力攪拌器、冰

11、箱、顯微鏡等及常規(guī)用具。壓力容器應(yīng)經(jīng)政府有關(guān)部門檢驗合格，符合GB 150要求。應(yīng)具有備用電源?；驹O(shè)施培養(yǎng)基配制室、搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室規(guī)模要配套，布局合理，其中培養(yǎng)基配制室空間潔凈度應(yīng)達(dá)到萬級以上，搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室要有調(diào)溫設(shè)施，空間潔凈度應(yīng)達(dá)到百級。菌種檢驗室和母種制作室要有相應(yīng)的實驗檢測設(shè)備和制種用的滅菌設(shè)施和常規(guī)用具。生產(chǎn)技術(shù)工藝流程工藝流程見圖1。發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)無菌空氣搖甁液體菌種母種活化基質(zhì)培養(yǎng)基配制投料滅菌發(fā)酵罐液體菌種發(fā)酵罐空消接種香菇液體菌種生產(chǎn)工藝流程品種選擇選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)、商品性好的香菇品種，從具有相應(yīng)資質(zhì)的供種單位引種且種性清楚。

12、引種后必須進(jìn)行適應(yīng)性出菇試驗驗證。母種活化母種活化配方及操作流程應(yīng)符合 NY/T 528要求。活化后母種質(zhì)量應(yīng)符合GB 19170要求。搖瓶液體菌種生產(chǎn)容器使用無色或近無色專用玻璃菌種甁，可用棉塞（梳棉或化纖棉）、硅膠塞、專用封口透氣膜封口。培養(yǎng)基配方可選用以下配方：配方1：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母膏3 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B1 5 mg，水1 L，pH 6.06.5；配方2：玉米粉20 g，葡萄糖20 g，酵母膏5 g，牛肉膏4 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，維生素B1 5 mg，水1 L，pH 6.06.5。生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB 5749要求，培養(yǎng)基

13、質(zhì)應(yīng)符合NY/T 528要求，玉米粉應(yīng)過20目篩。培養(yǎng)基配制按液體培養(yǎng)基配方配制，玉米粉先用水?dāng)嚢杈鶆颍b入搖瓶中，混合均勻，裝液量為搖甁容量的 2/53/5，瓶塞封口，并用硫酸紙或牛皮紙包扎。滅菌將分裝好的搖瓶放入滅菌鍋內(nèi)，鍋內(nèi)留有一定的空隙。檢查鍋內(nèi)水位，立即滅菌。滅菌蒸汽壓力升至0.1 MPa0.12 MPa，恒壓維持35 min40 min。接種待培養(yǎng)基冷卻后于消毒過的超凈工作臺上，用經(jīng)火焰消毒并冷卻后的接種針挑取56塊（35）mm（35）mm的母種塊迅速轉(zhuǎn)接于待接種搖甁培養(yǎng)基內(nèi)。搖瓶菌種培養(yǎng)種結(jié)束后封口，放入恒溫箱中23 25 靜置培養(yǎng)1 d，然后置于搖床上震蕩培養(yǎng)，搖床溫度控制在2

14、3 25 ，轉(zhuǎn)速140 r/min160 r/min，培養(yǎng)時間10 d12 d。搖瓶菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液澄清透明，無雜菌、無異味；鏡檢無雜菌、菌絲形態(tài)正常；菌絲球、菌絲片段密集，不低于整個培養(yǎng)液80 %，均勻懸浮于液體培養(yǎng)基中不分層。發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)煮罐、空消發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長期放置、更換品種等情況出現(xiàn)其一時，應(yīng)煮罐和空消。蒸氣壓力0.15 MPa、溫度126 ，維持40 min。液體菌種培養(yǎng)基配方可選用以下配方：配方1：玉米粉20 g，葡萄糖20 g，酵母膏5 g，牛肉膏4 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1g，維生素B15 mg，消泡劑0.3 g，水1 L，pH 6.06.5；配方2

15、：馬鈴薯100 g（煮汁），葡萄糖10 g，麥麩40 g（煮汁），蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，消泡劑0.3 g，水1 L，pH 6.06.5；配方3：玉米粉20 g，麥麩20 g（煮汁），葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，消泡劑0.3 g，水1 L，pH 6.06.5。生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB 5749要求，培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)符合 NY/T 528要求，玉米粉應(yīng)過20目篩。投料和定容用水把淀粉、玉米粉等原料攪拌均勻，不能有結(jié)塊，通過吸管或漏斗加入罐體，裝液量為罐體容量的70 %80 %，加入0.03 %消泡劑，通入空氣攪拌1 min2 min，混合均勻，擰緊上料

16、口蓋。滅菌發(fā)酵罐加熱層通入冷水，水位低于排水口20 cm，關(guān)閉進(jìn)、排水閥門加熱。待加熱層蒸汽壓力達(dá)到0.05 MPa時，緩慢打開排氣閥降壓至0 MPa，關(guān)閉排氣閥，再次升壓至0.11 MPa；待發(fā)酵罐培養(yǎng)層蒸汽壓力達(dá)到0.05 MPa時，緩慢打開排氣閥降壓至0 MPa，關(guān)閉排氣閥，再次升壓至0.11 MPa，同時打開空氣過濾器滅菌，微開排氣閥，維持50 min60 min。冷卻滅菌結(jié)束，關(guān)閉空氣過濾器滅菌閥與排氣閥，緩慢打開空氣過濾器排水閥降壓至0 MPa，加熱層通入冷水降溫；同時緩慢打開發(fā)酵罐培養(yǎng)層排氣閥降壓，待壓力接近0 MPa時向培養(yǎng)層內(nèi)通入無菌空氣，調(diào)整排氣閥，維持罐壓0.04 MPa

17、0.05 MPa，培養(yǎng)液溫度降至25 以下時，關(guān)閉加熱層進(jìn)水閥。接種接入搖甁菌種，接種量為2 %4 %。將搖瓶接種管和發(fā)酵罐接種口用75 %酒精消毒，用95 %酒精的火焰圈套在接種口上，輕微打開呼吸器閥門，使發(fā)酵罐壓力為0 MPa。點燃火焰圈，在火焰保護(hù)下用鑷子去掉接種管上的牛皮紙和瓶塞，打開接種口閥門，將接種管插入接種口，將搖瓶菌種注入發(fā)酵罐。拔出接種管，關(guān)閉接種閥門，去掉火焰圈，打開空氣壓縮機(jī)。發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)根據(jù)菌絲生長情況，適時調(diào)節(jié)進(jìn)氣按鈕，通入適量無菌空氣，同時調(diào)節(jié)排氣閥，維持罐壓0.01 MPa0.03 MPa，培養(yǎng)溫度控制在23 25 ，培養(yǎng)9 d10 d。液體菌種檢測形態(tài)學(xué)觀察。

18、主要是通過肉眼觀察菌球形態(tài)，通過顯微鏡觀察菌絲體形態(tài)。霉菌檢驗。按照無菌操作從取樣閥取少量疑有霉菌污染的培養(yǎng)液，接種于GB/T 4789.28中規(guī)定的PDA培養(yǎng)基中，置于28 30 恒溫培養(yǎng)48 h，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長狀況和有無雜菌污染；若出現(xiàn)白色以外的雜色者，或有異味者為霉菌污染物，必要時進(jìn)行水封片鏡檢。細(xì)菌檢驗。按照無菌操作從取樣閥取少量疑有細(xì)菌污染的培養(yǎng)液，接種于GB/T 4789.28中規(guī)定的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，置于28 30 恒溫培養(yǎng)24 h48 h，觀察培養(yǎng)液是否渾濁。培養(yǎng)液渾濁，為有細(xì)菌污染；培養(yǎng)液澄清，為無細(xì)菌污染。pH測定。取樣用pH計或pH試紙測定菌液酸堿度。pH小于5為不正常。菌絲濕重測定。稱取一定體積的培養(yǎng)液，經(jīng)1 000 r/min 離心5 min，稱重。發(fā)酵罐液體菌種