透射電鏡常規(guī)樣品制備流程

1、透射電鏡樣品制備流程由于透射電鏡能觀察的樣品必須很?。?070nm），所以透射電鏡的樣品準(zhǔn)備要 求很嚴(yán)格，方法也很單一，僅有一下兩種方法：負(fù)染色技術(shù)負(fù)染色技術(shù)簡單快速，可以顯示生物大分子、細(xì)菌、分離的細(xì)胞器以及蛋白晶體 等樣品的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小以及表面結(jié)構(gòu)的特征。尤其在病毒學(xué)中，負(fù)染色技術(shù) 有著廣泛的應(yīng)用。樣品要求：樣品懸液的純度不要求很純，但是如果雜質(zhì)太多，如大量的細(xì)胞碎 片，培養(yǎng)基殘渣，糖類以及各種鹽類結(jié)晶的存在都會干擾染色反應(yīng)和電鏡的觀 察。尤其是不能有過多的糖類，因為在電子束的轟擊下，糖類容易碳化而有礙觀 察，因此樣品要適當(dāng)提純。樣品懸液的濃度要適中，太稀在電鏡下很難找到樣 品，太濃樣

2、品堆積影響觀察。操作流程：吸取樣品懸液滴到有膜的銅網(wǎng)上，靜置 數(shù)分鐘，然后用濾紙吸去多余的液體，滴上負(fù)染色液，染色12min后濾紙吸去 負(fù)染色液，待干后用于電鏡觀察。二、超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù)是為透射電鏡觀察提供薄樣品的專門技術(shù)，是生物學(xué)中研究細(xì)胞超 微結(jié)構(gòu)最常用的技術(shù)。廣泛應(yīng)用于生物體的各種細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察。一般厚度在 10100nm的切片稱為超薄切片，制作這種切片的技術(shù)叫做超薄切片技術(shù)。超薄 切片制作的過程包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個 環(huán)節(jié)，和一般光學(xué)顯微鏡的石蠟切片過程相似。但是，超薄切片切片過程更為細(xì) 致與復(fù)雜，要求更嚴(yán)格，而且所用的試劑比較昂貴、配制復(fù)

3、雜、強致癌。具體操 作步驟、注意事項如下：取材和前固定：快速的切取大小為0.51.0mm3的樣品塊，一分鐘內(nèi)把組織 （樣品）塊浸入2.5%戊二醛（進(jìn)口品質(zhì)）溶液（取樣前來平臺領(lǐng)取），每個離心管內(nèi)裝 20個以上的樣品塊，作為一個樣送到平臺。要求：取材前一定要和工作人員取 得電話聯(lián)系！取材選擇部位要準(zhǔn)確可靠，確保每塊材料都是要觀察的部位。 所有植物樣品一定要抽真空，能夠沉底的樣品也抽真空15mins，不能沉底的樣品 一定要抽真空致沉底！細(xì)菌、散在細(xì)胞等不能成塊的樣品，加戊二醛固定液， 離心沉淀后送到平臺，由平臺工作人員處理。泡在前固定液的材料最多可以放 2周。漂洗：用 1M PBS Buffer

4、Ph 7.2 沖洗 3 次，每次 15mins。后固定：加入1%鋨酸處理到樣品變黑。植物樣品一般處理2.5hours，真菌、 細(xì)菌一般處理2hours,動物樣品處理Ihours。注意事項：鋨酸劇毒物質(zhì)，易揮發(fā)， 操作時要在毒品柜中謹(jǐn)慎使用。鋨酸比較昂貴，需特別節(jié)約使用。漂洗：用 1M PBS Buffer Ph 7.2 沖洗 3 次，每次 15mins。脫水：室溫下，丙酮30%50%70%80%90%每級作用30mins，純丙 酮在作用3次，每次作用30mins。滲透：其目的是使包埋劑逐步滲入組織細(xì)胞內(nèi)。植物樣品需要的滲透梯度 多、滲透時間長。其他樣品可以適當(dāng)減少或縮短滲透梯度和時間。以二葉齡

5、水稻葉片為 例，其滲透流程如下：無水丙酮/包埋劑=5： 1作用12hours 一無水丙酮/包埋劑= 3： 1作用12hours 一無水丙酮/包埋劑=1： 1作用12hours 一無水丙酮/包埋劑= 1： 3作用12hours一無水丙酮/包埋劑=1： 5作用12hours一純包埋劑作用45C作 用12hours。注意事項：包埋劑為強致癌劑，特別要注意規(guī)范操作！包埋：用牙簽將滲透好的樣品挑到包埋板中，45C聚合12hours，60C聚合3648hours。超薄切片：超薄切片的切片面積最大不能超過0.5mmx0.3mm，比較難切的植 物樣品要求切片面積更小。超薄切片是在超薄切片機上進(jìn)行，但是切出比較

6、理想的超 薄切片，卻是一件不容易的工作。做好需要有滲透、包埋好的包埋塊，還要有好 的切刀以及操作者的熟練技術(shù)等。超薄切片前期需要準(zhǔn)備載網(wǎng)和支持膜、修塊、 制刀等，前期準(zhǔn)備工作至少需要半天時間。超薄切片是極其精細(xì)、耗費眼力的工 作，需要靜下心來慢慢操作，切好一個樣品至少需要1小時。正染色：由于生物樣品主要由碳、氫、氧、氮等輕元素組成。這些元素原子 對電子的散射能力很弱，相互之間的差別也很小。尤其生物超薄切片被樹脂所包埋，這 些包埋樹脂對電子的散射能力與樣品本身差別很小。因此生物樣品超薄切片觀察 時像的反差極弱。為了提高圖像的反差，要對超薄切片進(jìn)行電子染色。這里所謂 電子染色是根本不同于光學(xué)顯微鏡的染色，它是利用重金屬鹽（如鉛鹽、鈾鹽 等）與細(xì)胞的某些成分或結(jié)構(gòu)結(jié)合，由于重金屬對電子散射能力很強，使那些與 其結(jié)合的結(jié)構(gòu)或成份對電子散射能力增強，從而達(dá)到提高樣品本身反差的。目前 最常用的染色劑是醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液。操作流程是：超薄切片先檸檬酸鉛 染色10分鐘，去二氧化碳的雙蒸水清洗3次，再用醋酸鈾染色30分鐘，雙蒸水 清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射電鏡觀察。注意事項：醋酸鈾具有 放射性，使用時要特別注意。檸檬酸鉛染液極易和