補陽還五湯對老齡大鼠腦缺血再灌注海馬齒狀回細(xì)胞增殖分化的影響

1、補陽還五湯對老齡大鼠腦缺血再灌注海馬齒狀回細(xì)胞增殖分化的影響【關(guān)鍵詞】補陽還五湯;老年;腦缺血再灌注;神經(jīng)干細(xì)胞;增殖;分化;大鼠腦缺血再灌注可激活腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移1。以往缺血性腦血管疾病的實驗研究多無視腦血管疾病中增齡因素的重要性,致使青年動物的實驗研究結(jié)果與臨床有較大差距，有關(guān)老齡大鼠神經(jīng)再生特點鮮見報道。補陽還五湯(BHD)治療腦梗死具有明顯效果2，機制可能與其改善微循環(huán)和拮抗血栓形成及細(xì)胞凋亡有關(guān)3，4。本研究以老齡大鼠為研究對象,從海馬齒狀回細(xì)胞增殖和分化的變化等方面提醒補陽還五湯拮抗老年腦缺血再灌注損傷機制。1材料與方法1.2動物分組、模型制備及BrdU標(biāo)記采用改進(jìn)的B

2、edersn等5法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型。設(shè)假手術(shù)組、模型組(根據(jù)缺血及再灌注時間不同分為缺血3h，再灌注1、3、7、14d)、尼莫地平組(6gkg-1d-1)、BHD組(13gkg-1d-1)，每組每個時間點為6只大鼠,造模前5d開場灌胃給藥，造模前2h加灌一次，假手術(shù)組和模型組灌生理鹽水。各組均于術(shù)后4h腹腔注射10g/LBrdU(50g/kg,1次/d)。4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，脫水固定，石蠟包埋切片(免疫組化、光鏡病理)。1.3觀察指標(biāo)及方法1.3.1神經(jīng)功能障礙評分參考吳俊芳6提出的8個等級評分標(biāo)準(zhǔn)，各組各時間點動物均進(jìn)展神經(jīng)功能障礙評分。1.3.2腦組織含水量各組各時間

3、點動物均斷頭取腦組織，標(biāo)本用分析天平分別測定其濕重及在電熱恒溫枯燥箱中100枯燥48h后的干重，以計算含水量。公式如下：含水量=(濕重-干重)/濕重100%。余腦組織脫水固定，石蠟包埋切片(光鏡病理、免疫組化)。1.3.3病理觀察各組各時間點動物均常規(guī)HE染色，光鏡下進(jìn)展病理觀察。2.5%戊二醛溶液、1%鋨酸固定,常規(guī)制作超薄切片,經(jīng)醋酸鈾及檸檬酸鉛雙染色后,透射電鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管等超微構(gòu)造。1.3.4BrdU、NeuN和GFAP測定BrdU陽性細(xì)胞采用免疫組化方法測定、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP采用雙標(biāo)記染色,全自動彩色圖像處理系統(tǒng)進(jìn)展圖像分析，各組各時間點每

4、只大鼠隨機選取5張非連續(xù)的腦片，在400鏡下，每張切片取缺血側(cè)的DG個3個視野，計數(shù)BrdU陽性細(xì)胞數(shù);雙標(biāo)結(jié)果每張切片選取10個視野，計數(shù)BrdU陽性細(xì)胞及BrdU/NeuN或BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞，計算雙標(biāo)細(xì)胞陽性率。1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0軟件包進(jìn)展統(tǒng)計分析，采用方差分析統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)均以xs表示。2結(jié)果2.1病理觀察老齡模型組(I/R1d、I/R3d)可見神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，排列紊亂，出現(xiàn)典型的梗死灶，神經(jīng)元數(shù)目減少。血管周圍高度水腫、構(gòu)造欠明晰，炎性細(xì)胞浸潤明顯，形成“血管套。BHD組可見神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞排列輕度紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、深染及腫脹。血管

5、輕度擴張水腫，部分血管受壓變形，管周圍有炎性細(xì)胞浸潤,細(xì)胞間隙輕度水腫。與同時間點模型組比擬病理損傷均減輕，該藥物可以明顯減輕腦缺血再灌注損傷。2.2電鏡觀察模型組3h后神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)水腫，線粒體水腫，嵴和膜消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，染色質(zhì)濃縮及邊緣聚集。3d超微構(gòu)造破壞到達(dá)最嚴(yán)重，胞質(zhì)、胞核高度水腫，線粒體水腫，嵴模糊、消失。714d細(xì)胞超微構(gòu)造破壞略減輕。尼莫地平組14d神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞超微構(gòu)造較模型組病理變化明顯減輕,僅見線粒體嵴排列輕度紊亂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度脫顆粒，可見大量線粒體，線粒體周圍輕度水腫。BHD組3d以后腦細(xì)胞的超微構(gòu)造病理變化明顯減輕,胞質(zhì)中可見脂褐素，線

6、粒體僅有輕度水腫，嵴底部分消失，膜部分消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常，其余細(xì)胞器正常，14d觀察細(xì)胞質(zhì)、胞核、細(xì)胞器根本正常。2.3BHD對腦組織含水量和神經(jīng)病癥積分變化的影響模型組腦組織含水量(I/R1、3、7d)、神經(jīng)病癥積分(各時間點)均高于假手術(shù)組;BHD組神經(jīng)病癥積分、腦組織含水量(I/R3、7、14d)低于模型組;BHD組神經(jīng)病癥積分(I/R7、14d)低于尼莫地平組。見表1。2.4BHD對海馬齒狀回BrdU、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目的影響模型組BrdU陽性細(xì)胞(各時間點)、BrdU/NeuN雙標(biāo)陽性細(xì)胞(各時間點)、BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞(I/R7、14、

7、21d)數(shù)目均高于假手術(shù)組;BHD組BrdU陽性細(xì)胞(各時間點)、BrdU/NeuN雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)目(各時間點)高于模型組,BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞(I/R3、7、14d)變化相反;BHD組BrdU陽性細(xì)胞(I/R7、14d)、BrdU/NeuN雙標(biāo)陽性細(xì)胞(I/R7d、I/R14、21d)數(shù)目高于尼莫地平組。見表2。表1BHD對老齡大鼠腦組織含水量和神經(jīng)病癥積分影響比擬表2BHD對海馬齒狀回BrdU、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目的影響與假手術(shù)組比擬：1)P0.05,2)P0.01;與模型組一樣時間點比擬：3)P0.05,4)P0.01;與尼莫地平組一樣時間點比擬：

8、5)P0.05,6)P0.01轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論腦梗死是臨床上常見的缺血性腦血管疾病，致殘率和致死率均較高。腦缺血后常引起神經(jīng)元喪失,導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失。目前,對于腦缺血損傷后的功能恢復(fù)主要集中在促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和干細(xì)胞移植7。盡管腦缺血后成年腦內(nèi)增殖區(qū)的細(xì)胞發(fā)生明顯的增殖性反響,但由于細(xì)胞數(shù)量有限可能缺乏以產(chǎn)生功能恢復(fù)性影響。雖然外源性的干細(xì)胞移植可彌補上述缺乏,但由于干細(xì)胞移植需要外在的細(xì)胞資源如胚胎非人類組織以及培養(yǎng)的細(xì)胞,這些移植物的應(yīng)用,可能引起新的疾并免疫排擠和需要長期使用免疫抑制劑等問題。神經(jīng)再生出如今成年腦內(nèi)不連續(xù)的區(qū)域，主要包括海馬齒狀回顆粒下層、側(cè)腦室室管膜

9、及室管膜下區(qū)兩個主要聚集區(qū)域，側(cè)腦室室管膜及室管膜下區(qū)新生的神經(jīng)元可通過嘴側(cè)遷徙流移至嗅球和皮層;海馬齒狀回顆粒下層新生的神經(jīng)元可移至海馬顆粒層8。因此,發(fā)動內(nèi)源性干細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生是促進(jìn)腦缺血后損傷修復(fù)的有效途徑。氣虛血瘀證貫穿于腦卒中病的始終，益氣活血為治療腦卒中之大法。BHD由黃芪、歸尾、川芎、桃仁、紅花、芍藥和地龍等藥物組成,具有補氣活血、通經(jīng)活絡(luò)成效，可有效改善腦血流及血液流變，拮抗興奮性氨基酸毒性及合理調(diào)控一氧化氮合成酶(NS)的表達(dá)，拮抗腦缺血及再灌注損傷，主要用于治療缺血性腦梗死及其后遺癥3，4，9。BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核昔類似物，在細(xì)胞S期可以標(biāo)記DNA合成，為胞核表達(dá)活

10、性物，標(biāo)記細(xì)胞核,因此BrdU陽性細(xì)胞可被看作具有增殖活性的細(xì)胞10。Kaai等11采用四動脈阻斷法制作成年大鼠短暫性全腦缺血模型,觀察到缺血后5、7、9dDG中BrdU細(xì)胞數(shù)增加,28d時增殖細(xì)胞分化為神經(jīng)元。Zhang等12利用大腦中動脈栓塞(A)模型,發(fā)現(xiàn)室管膜下區(qū)(SVZ)的NSs在缺血后1d即開場增殖,11d到達(dá)頂峰，腦缺血不僅可以促使缺血側(cè)SVZ和顆粒下層(SGZ)的NSs增殖,而且可影響到對側(cè)大腦半球SVZ和SGZ的NSs,其增殖效應(yīng)并不依賴于增殖區(qū)部分是否有受損的神經(jīng)元,這一過程可能是機體對缺血損傷產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)反響。本組資料說明，BrdU陽性細(xì)胞胞核有兩種形態(tài):一種胞核較大深

11、染呈圓形,另一種胞核淡染呈橢圓形,但以前者為主。胞核的形態(tài)變化和染色深淺可能與腦老化和神經(jīng)干細(xì)胞的分化有關(guān)，胞核大深染呈圓形的分化為神經(jīng)元，淡染呈橢圓形多分化為膠質(zhì)細(xì)胞。正常成年腦組織中，海馬中只有少量BrdU陽性細(xì)胞存在，腦梗死后BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增加,出如今海馬(顆粒層和齒狀回更為明顯)、SVZ及梗死邊緣，714d達(dá)頂峰，后漸減少，說明腦梗死可以誘導(dǎo)腦內(nèi)自體神經(jīng)干細(xì)胞原位增殖，但這不是腦梗死的直接結(jié)果，可能是引起了腦內(nèi)某些因子的變化，通過不同途徑作用于腦內(nèi)處于靜止期的神經(jīng)干細(xì)胞引起增殖改變。補陽還五湯作用后1dDGBrdU陽性細(xì)胞明顯增加，7d達(dá)頂峰，14d仍維持較高程度，較模型組(

12、各時間點)和尼莫地平組(I/R7、14d)BrdU陽性細(xì)胞明顯增多，且增殖頂峰提早，持續(xù)時間延長，說明補陽還五湯可促進(jìn)DG神經(jīng)細(xì)胞增殖，并在一定時間窗內(nèi)增強，這為臨床治療可以早期給藥提供了理論根據(jù)。NeuN是神經(jīng)元的標(biāo)記蛋白13，GFAP是星型膠質(zhì)細(xì)胞活化及增殖的標(biāo)志物14，BrdU/NeuN雙標(biāo)陽性細(xì)胞代表增殖的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，BrdU/GFAP雙標(biāo)的陽性細(xì)胞代表增殖的神經(jīng)干細(xì)胞分化方向為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，BrdU/NeuN+和BrdU/GFAP+細(xì)胞在腦缺血后3d開場增多，714d達(dá)頂峰，說明腦缺血激活了原位神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，逐漸向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。BHD治療后，BrdU/NeuN+1d即開場增多，