肺癌ALK靶點檢測研究進展講義

1、肺癌ALK靶點檢測研究進展1994年ALK基因異常首次在淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)ALK基因異常首次在間變性大細胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn) (ALCL), 并因此而得名“ALK” （anaplastic lymphoma kinase）間變性大細胞淋巴瘤激酶ALK融合到核磷蛋白（NPM）的N-末端部分 (NPM-ALK)導(dǎo)致ALK基因組成性激活。Science 1994;263:12814Blood 1997;89:1678852007年首次在非小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因EML4EML4ALK variant 1HELP1496981WDBasic14961059110581620TMKinaseAL

2、KEML4-ALKNMP-ALKNature 2007;448:56172007年首次在非小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合類型，并證實為肺癌的驅(qū)動基因。并且越來越多的研究表明ALK融合在NSCLC當中以較為穩(wěn)定的頻率出現(xiàn)，大約5%。Permanent proliferation & inhibition of apotosisEML4-ALK fusion proteinsilenced bycrizotinibProliferation & survivalupon ligand bindingto ALKALK融合突變在蛋白水平的變化配體ALK受體細胞外細胞內(nèi)正常ALK 信號細胞外永久

3、擴增和凋亡抑制細胞外克唑替尼抑制EML4-ALK 融合蛋白病理性ALK信號克唑替尼作用模式 配體與ALK結(jié)合后，擴增和存活由于與EML4融合，ALK激酶區(qū)異常激活多效蛋白?肝素結(jié)合細胞因子?隨著ALK靶向抑制劑的發(fā)現(xiàn)，ALK基因越來越多的受到重視2007, Soda & Mano首次發(fā)現(xiàn)EML4-ALK基因2009, Alice T. Shaw首次出現(xiàn)EML4-ALK陽性非小細胞肺癌的稱謂，并將其定義為NSCLC的獨特亞型2010, Kwak EL:證實克唑替尼治療有效，但仍沿用EML4-ALK陽性非小細胞肺癌的稱謂Soda M, et al. Nature 2007; 448(7153):5

4、61-566.Shaw AT, et al. J Clin Oncol 2009; 27:4247-4253.Kwak EL, et al. N Engl J Med 2010; 363:1693-1703.NSCLC臨床病理分型的演變AdenocarcinomaSquamous-cell carcinomaLarge cell carcinoma組織分型 Current Standard of NSCLC CareNon-squamousNSCLC 分型現(xiàn)狀SquamousEGFR WTEGFR MuSquamousEGFR MuKRAS MuALK+Other non-squamous W

5、TSquamous2012NCCN2014NCCNEGFR MuALK+KRAS MuOther non-squamous WTSquamousROS1+2010NCCNNCCN Guidelines, NSCLC, Version 4. 2014Horn L, et al. Clin Oncol. 2009驅(qū)動基因分型 早期NSCLC分子分型與治療決策密切相關(guān)HER2EGFR mutantsALKROS/RETb-rafK-rasChemotherapy and PCIAdenoLCC/NOSSCCSCLCK-rasALK陽性非小細胞肺癌有哪些特點？ALK陽性NSCLC具有鮮明的臨床及病理特

6、征特征EGFR突變EML4/ALK組織學(xué)腺癌 TTF1+腺癌TTF1+亞型非粘液型粘液型吸煙狀態(tài)不吸煙不吸煙人種東亞所有人種發(fā)病年齡66歲52歲性別女性無差異Shaw AT, et al. J Clin Oncol 2009; 27:4247-4253.85.4%的ALK陽性NSCLC年齡65歲(PROFILE1007)與EGFR突變?nèi)巳合啾?，ALK融合人群年齡更輕ALK陽性患者的中位年齡比EGFR陽性患者中位年齡小15歲低年齡組ALK陽性率高于EGFR在低于51歲的人群中，ALK陽性率高于EGFR陽性率，可達18.5%，所以對于年輕患者來說，在標本限制的情況下建議先檢測ALK靶點。Scien

7、tific Reports; Li Zhang,2014不同人種中克唑替尼的療效的差異ID患者數(shù)ORR(%)PFS（月）所有亞裔(%)所有非亞裔亞裔中國所有非亞裔亞裔中國PROFILE100114941(28)60.854.876.9-9.7-PROFILE100525993(36)59.8547073.98.1-PROFILE1007347157(45)65-74.7757.77.18.1-PROFILE1014343157(46)747270-10.9-13.6-Fei-Yu Niu, Yi-Long Wu. Onco Targets and Therapy 2 May 2015 亞裔或者

8、中國患者，ORR維持在70%以上；克唑替尼一線治療亞裔患者，中位PFS達到13.6個月什么樣的人群需要進行ALK檢測？更新內(nèi)容2011版2015版對臨床實踐影響診斷病理報告內(nèi)容未提及分子病理診斷結(jié)果診斷內(nèi)容包括腫瘤部位、組織學(xué)亞型、累及范圍（支氣管、胸膜、脈管、神經(jīng)、伴隨病變類型、肺內(nèi)播散灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）、切緣及必要的特殊染色、免疫組化結(jié)果或分子檢測結(jié)果。包含的信息應(yīng)滿足臨床分期的需要，并給出pTNM分期。規(guī)范診斷：標準NSCLC診斷需盡可能注明EGFR & ALK基因狀態(tài)（如：右肺上葉腺癌T3N2M1（骨）-IV期 ALK融合基因陽性）NSCLC驅(qū)動基因檢測未推薦EGFR & ALK檢

9、測對于晚期NSCLC、腺癌或者含腺癌成分的其他類型肺癌，應(yīng)在診斷的同時常規(guī)進行表皮生長因子（EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突變檢測，檢測前應(yīng)有送檢標本的質(zhì)控（包括亞型確認及樣本量確認）。檢測標本類型包括活檢組織、細胞學(xué)標本和細胞蠟快，檢測方法推薦使用獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的檢測方法或試劑。常規(guī)檢測：晚期NSCLC診斷同時，需常規(guī)檢測EGFR & ALK基因狀態(tài)（特殊情況除外）非小細胞肺癌靶向個體化診療策略更新要點P71P69腺癌/大細胞癌/NOS應(yīng)該進行EGFR及ALK檢測少吸煙/小活檢肺鱗癌，不能排除混合性成分，需要進行EGFR/ALK檢測為了識別出已經(jīng)有有效藥物治療

10、的罕見驅(qū)動基因靶點，NCC指南強烈推薦對腫瘤病人進行更廣譜的腫瘤驅(qū)動基因檢測，或為病人推薦可獲得的臨床研究。廣譜的驅(qū)動基因篩查是改善NSCLC預(yù)后的關(guān)鍵Version 4.2016強調(diào)分子檢測的重要性如何檢測ALK融合突變？CFDA獲批的三種診斷方法ALK break-apart FISH assay(Abbott Molecular, Vysis probes)ALK immunohistochemistry(Roche Ventana)SplitIsolated redAmoy Dx EML4-ALK融合基因檢測試劑盒RT-PCR（廈門艾德）熒光原位雜交（FISH）5ALKEML43陽性（

11、分離 倒位）2p23-215ALKEML43倒位（70）基因融合陰性兩個信號之間的距離小于2個信號直徑 12 Mb本圖由Lukas Bubendorf提供實時逆轉(zhuǎn)錄法（RT-PCR）原理20逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV）催化合成cDNA第一條鏈加入PCR成分用Takara Ex TaqTM HS合成cDNA第二條鏈擴增cDNART- PCR試劑盒的原理EML4ALK上游引物下游引物融合點檢測探針VENTANA IHC 試劑設(shè)計ALK融合蛋白:無ALK重排的NSCLC不表達ALK融合蛋白部分ALK融合蛋白表達較低Ventana IHC的原理:使用具有高度敏感性和特異性的一抗D5F3全自動儀操作，充分保證特異

12、性獨有Optiview擴增技術(shù)，充分保證敏感性D5F3 rabbitt monoclonal antibodyOptiview DAB IHC DetectionOptiview Amplification Kit01+2+3+NegPosPosPosCST-IHCVentana-IHCPosVentana-IHC原理：在常規(guī)IHC之后加入擴增信號，并且通過充分洗滌一抗避免假陽性-創(chuàng)建一個“二元”的判讀系統(tǒng)J.Ying,et al. Annals of Oncology 2013;Ventana IHC與FISH檢測結(jié)果比較FISH總數(shù)敏感性特異性一致率陽性陰性Ventana IHC(1)陽性

13、46753100%98.20%98.40%陰性0377377Ventana IHC(2)陽性3103194%100%99.10%陰性2198200Ventana IHC(2)陽性32032100%100%100%陰性0217217Ventana IHC(3)陽性4024291%96%94%陰性45357Ventana IHC(4)陽性1801890%100%99.60%陰性2503505Ventana IHC(5)陽性63265100%98.4%98.9%陰性0131131(1)Jinghui Wang,et al. PLoS ONE 2014 9(7): e101551(2) Eugen C

14、. Minca,et al. J Mol Diagn 2013, 15: 341-346(3) Murry W. Wynes,et al. J Thorac Oncol. 2014;9: 631638(4) Greta,et al. Arch Pathol Lab Med. doi: 10.5858/arpa.2013-0388-OA（5）J.Ying;et al. Annals of oncology.2013,24:2589-2593全自動VENTANA IHC優(yōu)勢一判讀標準簡單，僅存在陰性 or 陽性的判讀IHC 陽性 = FISH 陽性全自動VENTANA IHC優(yōu)勢二全自動檢測，避免操作流程中的誤差，可重復(fù)性好全自動VENTANA IHC優(yōu)勢三價格便宜，可同時用于ALK的篩選和診斷EMEA（歐盟）、CFDA批準Ventana