蝴蝶蘭組織培養(yǎng)課件

1、蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)教學(xué)目標(biāo)工作任務(wù)實踐操作問題探究知識拓展項目實踐教學(xué)內(nèi)容作 業(yè)教學(xué)終極目標(biāo)會蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)和快速繁殖的技術(shù)方法和流程。能熟練進行蝴蝶蘭花梗側(cè)芽的消毒和培養(yǎng) 能進行原球莖誘導(dǎo)、繼代、生根與煉苗促 成 目 標(biāo)教學(xué)目標(biāo)項目介紹 蝴蝶蘭：蘭科，蝴蝶蘭屬；別名：蝶蘭，拉丁名：Phalaenopsis amabilis蝴蝶蘭是單莖性附生蘭，莖短，葉大，花莖一至數(shù)枚，花大，因花形似蝶得名。其花姿優(yōu)美，顏色華麗，為熱帶蘭中的珍品，有“蘭中皇后”之美譽。 蝴蝶蘭屬的拉丁學(xué)名是由Phala（蛾蝶）和Opsis（模樣）組成，意指花外形似蛾蝶。該屬植物約有4個原生種，主要分布在南北緯度23

2、度之間，從喜馬拉雅山經(jīng)印度、緬甸、中國南部、馬來西亞、菲律賓、澳大利亞和新幾內(nèi)亞。我國云南南部、西藏南部、廣東南部、海南和臺灣一線為該屬植物的最北分布界限。 蝴蝶蘭屬熱帶氣生蘭植物，原生種有70多種，原產(chǎn)于我國臺灣、菲律賓、印度尼西亞等地。蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，植株很少發(fā)育側(cè)芽，花似蝴蝶，色澤豐富，形態(tài)美妙，花期長達(dá)3-4個月，深受各國人民歡迎。 蝴蝶蘭工作任務(wù)由蝴蝶蘭花梗誘導(dǎo)腋芽 任務(wù)1對初代培養(yǎng)物誘導(dǎo)形成原球莖 任務(wù)2對試管苗進行試管內(nèi)生根培養(yǎng) 任務(wù)3對生根苗進行馴化和移栽 任務(wù)4蝴蝶蘭的繁殖 蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，植株上極少發(fā)育側(cè)枝，比其他種類的蘭花更難于進行常規(guī)無性繁殖。組織培養(yǎng)是建立

3、蝴蝶蘭快速繁殖無性系的重要手段。 為了大量繁殖，實現(xiàn)大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)，采用蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)。取用蝴蝶蘭新鮮、側(cè)芽飽滿的花梗進行無菌培養(yǎng)，產(chǎn)生單株小苗。再進行試管苗莖尖培養(yǎng)，誘導(dǎo)為原球莖體。經(jīng)原球莖培養(yǎng)，繼代擴大增殖，可培養(yǎng)成蝴蝶蘭小植株。蝴蝶蘭種子的無菌培養(yǎng)材料選擇和消毒花梗消毒和接種初代培養(yǎng)繼代增殖生根培養(yǎng)實踐操作花梗側(cè)芽培養(yǎng)壯苗培養(yǎng)誘導(dǎo)原球莖花梗側(cè)芽的消毒與培養(yǎng) 自來水沖洗，洗衣粉液浸泡57min，自來水反復(fù)洗 外植體的選擇預(yù)處理滅菌接種 75%酒精 浸泡30s左右，0.1%升汞消毒1020min，無菌水沖洗3次 培養(yǎng)基:MS+BA 3-5mg/l+胰蛋白胨2g+椰乳30g+糖35g+瓊

4、脂12g/L，pH=5.0-5.4 溫度:2528；光照1012h；光強15002000lx。 培養(yǎng)1、選材與消毒:75%酒精30S，0.1%升汞5min種子 ： MS+BA0.5/L +NAA0.1/L+3%蔗糖。60天?；ü＃?/2MS+BA5.0/L +NAA0.5/L培養(yǎng)基。4周2、初代培養(yǎng)種子： MS+BA5.0/L 培養(yǎng)基上。60天，4cm高實生苗花梗：MS+BA5.0/L 培養(yǎng)基上。4w苞葉處叢生小芽3、繼代培養(yǎng)與育苗 將原球莖切成數(shù)塊轉(zhuǎn)移到新鮮的初代培養(yǎng)基上，附加15%椰乳、 0.5/L +LAA6.0/L腺嘌呤。4、試管苗的移栽與管理技術(shù) 試管苗的出瓶移栽技術(shù)與大花蕙蘭相同。

5、蝴蝶蘭花梗組織培養(yǎng)蝴蝶蘭腋芽萌發(fā)葉基部、葉中段、葉尖部MS+BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+蘋果汁80g/L+蔗糖30g/L+瓊脂10g/L+活性炭1g/L為好。培養(yǎng)條件：25，600lx，pH5.45.6以基部0.51.0cm，上表面朝上平放為好 試管苗莖尖的培養(yǎng)材料: 試管苗莖尖0.3mm左右培養(yǎng)基:MS+BA 36mg/l+椰乳溫度: 2528光強: 光照時間810h/d14d后莖尖膨大，呈淺綠色半球狀，3個月后，可誘導(dǎo)原球莖。原球莖培養(yǎng)原球莖誘導(dǎo) 試管苗的嫩葉：MS+BA 46mg/l+IBA 0.51mg/l+胰蛋白胨2g/l+椰乳40g/l 2528，15002000lx

6、，光照10h/d，逐漸出現(xiàn)愈傷組織狀的早期原球莖。原球莖繼代培養(yǎng) 將原球莖切割長數(shù)小塊， 繼代培養(yǎng)5060d轉(zhuǎn)接一次，增殖倍數(shù)為1012，實現(xiàn)蝴蝶蘭生產(chǎn)的工廠化育苗。生根與煉苗 生根：MS+IAA0.5 70多天后，具45條根 的小苗，可出瓶種植。 煉苗：置于室溫710 d后，打開瓶蓋2天，取出小苗假植于水苔上。商業(yè)化生產(chǎn)問題探究問題探究1如何選擇蝴蝶蘭外植體？2什么是原球莖？3什么是胚狀體的發(fā)生？4什么是人工種子？ 如何選擇蝴蝶蘭外植體？ 蝴蝶蘭進行組織培養(yǎng)快速繁殖常用的外植體主要有莖尖、莖段、葉片、根尖、根段、花梗腋芽、花梗節(jié)間切段、幼胚、種子等。各個外植體培養(yǎng)成功的難易程度不同，誘導(dǎo)率不

7、同，適于的誘導(dǎo)培養(yǎng)的途徑不同。 莖尖是較容易誘導(dǎo)培養(yǎng)、成功率較高的部位,但蝴蝶蘭為單莖性植物, 摘取其莖尖就有可能損失母株, 造成浪費。 葉片作為外植體既可減少對母株的傷害,且取材不受季節(jié)限制。 利用花梗及花梗芽作為外植體進行培養(yǎng)就是代替蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)的一種方法，是目前進行蝴蝶蘭組培快繁最常選用的外植體。 什么是原球莖？ 原球莖最初是蘭花種子發(fā)芽過程中的一種形態(tài)學(xué)構(gòu)造。種子萌發(fā)初期不出現(xiàn)胚根，而是原胚的萌動和膨大，種皮的一端破裂，膨大的胚呈小圓錐狀，稱作原球莖。以后原球莖頂端產(chǎn)生突起，出現(xiàn)鱗片狀葉原基，形成子葉。也可理解為縮短的、呈珠粒狀的、由胚性細(xì)胞組成的、類似嫩莖的器官。一、概念：1、胚胎

8、發(fā)生: 胚的發(fā)育過程。 2、體細(xì)胞胚胎或胚狀體，簡稱體胚。 在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生、發(fā)育過程形成雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。 含義：不同于合子胚，它不是兩性細(xì)胞融合的產(chǎn)物；不同于孤雌胚或孤雄胚，它不是無融合生殖的產(chǎn)物； 不同于組培中器官發(fā)生途徑形成的莖芽和根；它是一個與合子胚的發(fā)育過程相似、具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。什么是胚狀體的發(fā)生？合子經(jīng)過短期的休眠后進行不均等分裂，產(chǎn)生一個較大的基細(xì)胞和一個較小的頂端細(xì)胞。 頂端細(xì)胞經(jīng)若干次分裂后形成原胚，再依次經(jīng)過球形期、心形期、魚雷形期和成熟期最終成為成熟胚.胚狀體概念：體細(xì)胞胚或花粉胚是指在植物組織培養(yǎng)中起源于1個非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎

9、發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的胚狀結(jié)構(gòu)，通稱胚體。二、體細(xì)胞胚的發(fā)生過程：胚性愈傷組織誘導(dǎo)；體胚誘導(dǎo)；體胚早期分化發(fā)育；體胚成熟；體胚再生。Comparison of moncot and dicot and gymnosperm somatic embryosA. Somatic embryo of orchardgrass growing from an embryogenic callus: coleoptile and notchB. Somatic embryo of grape growing from an embryogenic callus: two flattened cotyl

10、edons and subtending hypocotylC. Somatic embryo of Norway spruce: multiple cotyledons and elongated hypocotyl.三、胚狀體發(fā)生的方式：體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方式有直接、間接兩種：從培養(yǎng)中的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體直接分化成胚，中間不經(jīng)過愈傷組織階段。外植體首先發(fā)生脫分化，然后由愈傷組織細(xì)胞分化為胚。后者較為常見。 間接發(fā)生方式一般要有胚胎發(fā)生叢與胚狀體發(fā)育兩個過程。胚胎發(fā)生叢是指細(xì)胞質(zhì)濃、體積小常常聚集叢生、且高度分化的一些愈傷組織細(xì)胞。小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)四、影響器官和胚狀體形成的因素1、

11、培養(yǎng)基成分外源激素的種類、激動素與生長素的比例、激素的種類與濃度調(diào)控著細(xì)胞培養(yǎng)方式及器官發(fā)生的類型。無機物與有機物：PO4-3促進芽的分化。水解酪蛋白加強激素誘導(dǎo)芽分化作用,水解酶蛋白能促進根的生長。氮素含量與生長素的比例、以及氮的形式與體胚的形成有關(guān)。維生素：硫胺素與肌醇。培養(yǎng)基的物理性質(zhì)，如液體/固體、pH值、滲透壓的大小、糖的濃度等等。2、培養(yǎng)材料的類型及生理狀態(tài)3、愈傷組織的生理狀態(tài)及遺傳特征的影響 愈傷組織在增殖培養(yǎng)基上生長過久，致使組織衰老，往往會推遲器官的分化或不分化。處于旺盛生長時期的愈傷組織作為誘導(dǎo)器官分化的材料較好。 經(jīng)長期繼代培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中無需再加入生長物質(zhì)就可維持生長

12、，這種現(xiàn)象稱為“自發(fā)生長” 或組織的“馴化”。這些愈傷組織雖然能自發(fā)生長，但分化能力降低。愈傷組織的分化，不同植物之間有很大的差異。 在愈傷組織的長期培養(yǎng)中，常見細(xì)胞的染色體組發(fā)生變化，而表現(xiàn)出遺傳上的不穩(wěn)定性。 胚狀體與不定芽的區(qū)別胚狀體和不定芽在組織學(xué)上的三個不同特征：最根本的特征是具有兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性。胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系。胚狀體的維管組織的分布是獨立的“v”字形，而不定芽的維管組織無此現(xiàn)象。 胚狀體也是植物組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生最常見

13、而重要的方式，它較不定芽方式有更多的優(yōu)點： 胚狀體產(chǎn)生數(shù)量比不定芽多 胚狀體可制成人工種子，便于運輸和保存； 胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。這些對 組織培養(yǎng)應(yīng)用于育種是十分有利而重要的。胚狀體與合子胚的比較合子胚胚狀體質(zhì)量萌發(fā)率高，質(zhì)量好萌發(fā)率低，質(zhì)量差來源受精卵體細(xì)胞胚柄有，明顯即使有也不明顯形態(tài)固定，體積相對較小復(fù)雜，常有兩個以上的子葉體積相對較大變異率低高知識拓展知識拓展知識拓展 文心蘭 大花蕙蘭石斛蘭中國蘭 大花蕙蘭大花蕙蘭為蕙蘭屬植物，原生種產(chǎn)于喜馬拉雅山、印度、緬甸、泰國等地，后經(jīng)人工雜交選育而成。植株及花均大，特別是四倍體植株，花朵大而優(yōu)美，花瓣肥厚，花色豐富多樣，花期長

14、，而且具有較強的耐寒性。它是第一個用莖尖進行試管快繁獲得再生植株的蘭科植物。1、選材與消毒 在2-4月間，選取大花蕙蘭假鱗莖上新生側(cè)芽，從基部與假鱗莖相接處切斷。長5-10cm，在70%的酒精中蘸一下3-4s，立即投入0.1%升汞溶液中滅菌20min，最后按無菌操作要求，剝出5mm左右的莖尖，放入0.05%升汞溶液中再次滅菌2min，將消毒后的莖尖切成2mm1.5mm的組織塊，接種到一準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上。每瓶最好只接種1塊外植體，減少相互感染的機會。2、初代培養(yǎng) 在Fonnesbech基本培養(yǎng)基中加入KT1.0/L+6- BA5.0/L+NAA0.5/L和10%椰子汁，將培養(yǎng)物置于搖床上，轉(zhuǎn)速為

15、160rpm,進行液體振蕩培養(yǎng)。適用溫度25度，每天光照12小時，光照強度2000lx。2周左右，可觀察到外植體膨大，6周左右形成綠色原球莖。 3、繼代培養(yǎng)與育苗 在原球莖分化出莖葉之前將其取出切成數(shù)小塊，轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上（與初代相同）。用液體振蕩培養(yǎng)可大大加速繁殖速度。每30-40d分割原球莖一次。將已出現(xiàn)葉原基或長出幼葉的原球莖轉(zhuǎn)移到含有10%的香蕉勻漿的Knudsone固體培養(yǎng)基后，3個月左右長成10-20cm的完整植株。4、試管苗的移栽及管理技術(shù) 試管苗生長至3-5cm，根2-3條，即可移栽。煉苗3-4d，取出試管苗后用自來水沖洗掉根部的瓊脂培養(yǎng)基，再定植。置于散光下，溫度20左右，

16、濕度90%以上，通風(fēng)好。文心蘭1.莖尖培養(yǎng) 從母株上切取莖尖進行表面消毒,再切割0.5-1大小的莖尖接種在MS+NAA0.2mg/L+椰子汁20g液體培養(yǎng)基上,黑暗靜置培養(yǎng)20d,然后置于光下培養(yǎng),待外植體轉(zhuǎn)綠后,移入誘導(dǎo)培養(yǎng) 基:MS+BA6mg/L+IBA0.5mg/L+香蕉汁40g+蘋果汁30g+馬鈴薯汁30g，固體培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25-28,光照度為1500lx,每天光照10-12h。大約30d左右,外植體開始膨大并形成原球莖。2.原球莖增殖 將原球莖取出,分割成小塊,轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng),原球莖逐漸長大,并長出新的原球莖,45d后,原球莖可增殖3倍左右。原球莖增殖的同時,部分原球

17、莖開始分化,逐漸形成幼苗。3.生根與煉苗 將幼苗切割開,分開轉(zhuǎn)入MS+NAA0.2mg/L的培養(yǎng)基中,20d后小苗基部可分化出1左右的根。文心蘭煉苗與蕙蘭煉苗技術(shù)相同。石斛蘭 石斛（Dendrobium nobile）是蘭科石斛屬植物的總稱，為蘭科中最大的屬。石斛蘭不僅具有觀賞價值，而且許多品種藥用價值極高，是中藥單方或復(fù)方中的重要成份。石斛蘭 石斛蘭是種類最多而栽培最廣泛的蘭科植物，原生種達(dá)1600余種。原產(chǎn)中國、日本、泰國、印度、菲律賓、澳大利亞和新西蘭等國家，大多數(shù)種類為熱帶氣生蘭。 石斛蘭生長快易繁殖，花的形態(tài)各異、優(yōu)美、花色艷麗多彩，花多而且花期長達(dá)數(shù)月，深得世界各地人民的喜愛。許多國家利用組織培養(yǎng)技術(shù)大量生產(chǎn)石斛蘭盆花及鮮切花，泰國、新加坡、馬來西亞等過已成為石斛蘭的生產(chǎn)國和出口國。1、采芽與消毒 將新生芽或帶側(cè)芽的假鱗莖，先沖洗干凈，在8%的漂白粉清夜中浸15-20min，再用無菌水沖洗干凈，