《細胞生物學》課件4細胞生物學的研究方法

1、細胞生物學研究方法第四部分內(nèi)容提要經(jīng)典技術(shù)-顯微及亞顯微結(jié)構(gòu)的觀察（現(xiàn)代分子細胞生物學技術(shù) ）細胞組分的分離和分析（細胞生物學與其他學科交叉的技術(shù)）細胞培養(yǎng)、細胞工程等相關(guān)技術(shù)（現(xiàn)代分子細胞生物學技術(shù) ）一、 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法顯微鏡的出現(xiàn)，結(jié)合細胞化學的方法，尤其是免疫細胞化學技術(shù)，細胞整體形態(tài)、細胞的結(jié)構(gòu)、細胞中的分子甚至原子都得以揭示。Figure 3-1. Resolving power. Sizes of cells and their components drawn on a logarithmic scale, indicating the range of objects

2、 that can be readily resolved by the naked eye and in the light and electron microscopes. 肉眼：0.2 mm; 光鏡：0.2 um; 電鏡：0.2 nm（一）、光學顯微鏡技術(shù)：光學顯微鏡技術(shù)是細胞生物學研究常用手段之一。光學顯微鏡構(gòu)成： 光學放大系統(tǒng)（包括物鏡和目鏡） 照明系統(tǒng) 支撐系統(tǒng)1 復式光學顯微鏡技術(shù)顯微鏡最為重要的性能參數(shù)是分辨率（指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離），而非放大倍數(shù)。性能參數(shù)：D值越小，分辨率越高（D值與光源波長成正比，與介質(zhì)折射率N成反比； 所以波長越短，分辨率越高，介質(zhì)折射率越大，

3、分辨率越高） 0.61 N sin（/2）分辨率 D=以波長最短的可見光（400-700nm）的藍光（450nm）為光源，空氣為折射介質(zhì)，光學顯微鏡最大分辨率0.3um ；以油為折射介質(zhì)，可以達到0.2um；如果以紫外線（200-300nm）作為光源，分辨率可達到0.1um。 光鏡下可以看到的結(jié)構(gòu)包括細菌、線粒體（0.5um大小，是光鏡下能清晰可見的最小物體）、中心體、核仁等，稱為顯微結(jié)構(gòu)。組織切片的制備取材固定脫水包埋切片脫蠟復水染色脫水透明封片觀察固定的目的是使細胞及其成分鎖定在原有的位置，常用的有乙醇、甲醇、甲醛、戊二醛等。常用的染色劑有蘇木精、伊紅、孔雀綠、蘇丹黑、考馬斯亮藍等，它們對

4、細胞某一特殊的亞細胞成分有特異的親和性。切片厚度1-10um有絲分裂中期固定的洋蔥根尖細胞中，福爾根染色的結(jié)果，特異顯示DNA使用明視野顯微鏡（bright-field microscope）很難觀察到小的、未經(jīng)染色的樣品，如：活細胞。相差顯微鏡（phase-contrast microscope）則易于觀察高透明的物體。2 相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)相差顯微鏡：利用光的衍射現(xiàn)象，通過增加相差板和環(huán)形光闌，將肉眼不能察覺的相位差轉(zhuǎn)變成振幅差，從而表現(xiàn)為肉眼可見的明暗區(qū)別。 樣品不需要染色，優(yōu)點是能觀察無色、透明的活細胞中的結(jié)構(gòu)。利用的是不同成分、部分的光衍射系數(shù)不同的特點。細胞培養(yǎng)中使用的倒置相

5、差顯微鏡，更便于觀察培養(yǎng)物中的活細胞。倒置顯微鏡：適合直接觀察培養(yǎng)的細胞結(jié)構(gòu)上物鏡和照明系統(tǒng)顛倒，光源來自上方，物鏡在載物臺的下方。倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)皿表面生長的小鼠細胞微分干涉顯微鏡：微分干涉反差（DIC）也叫做Normarski干涉，在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明的，與相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點，折射率差別更大，故可以產(chǎn)生三維效果更強的影像。利用光的干涉現(xiàn)象，以平面偏振光為光源，將厚度差轉(zhuǎn)變?yōu)槊靼挡?，適合觀察活細胞中較大的細胞器。微分干涉相差顯微鏡拍攝的毛口蟲暗視野顯微鏡： 利用丁達爾光學效應(yīng)的原理。 聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，

6、因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。主要觀察物體的輪廓，不能分辨內(nèi)部的微細結(jié)構(gòu)，適于觀察活細胞內(nèi)的細胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細菌和霉菌等。暗視野顯微鏡拍攝的變形蟲 Fig. Four types of light microscopy. (A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy. (B) phase-contrast microscop

7、y, (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D) dark-field microscopy（暗視野顯微鏡）. 使用不同類型的光學顯微鏡觀察到的細胞的比較(a) 明場(b) 相差(c) 微分干涉反差（DIC）Video-enhance(contrast) microscopy（錄像增差顯微鏡） 將計算機輔助系統(tǒng)應(yīng)用于微分干涉顯微鏡，觀察和記錄活細胞中顆粒及細胞器的運動。3 熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡的原理是利用一定波長的紫外線作為光源來激發(fā)標本中存在的熒光物質(zhì)，使其發(fā)出不同顏色的光而成像。是目前光鏡水平對

8、蛋白等大分子定性定位研究的重要工具。包括兩套濾光片，激發(fā)光濾片（只讓能激發(fā)特殊熒光染料的波長通過）和阻斷濾片（只允許熒光通過），在黑暗的背景上，發(fā)出熒光的樣品很容易被觀察到。熒光顯微鏡有些生物體中的天然物質(zhì)受到紫外線照射能夠發(fā)出熒光，有些成分則不發(fā)光或熒光微弱，需要特定的熒光染料染色顯示。常用熒光染料： DAPI(聯(lián)脒基苯吲哚)和碘化丙錠可以染DNA； 吖啶橙可以染DNA和RNA； 熒光黃（fluorescein）受到藍光激發(fā)產(chǎn)生強烈的綠色熒光；羅丹明（rhodamine）受到黃綠色光激發(fā)可產(chǎn)生深紅色熒光，分別與抗體耦聯(lián)，可以觀察兩種不同抗原分子在同一細胞內(nèi)的分布。Rat aortic smo

9、oth muscle cells are labeled with the same dyes as the CHO cells. The nuclear DNA is stained by Hoechst (blue), the mitochondria stained by MitoTracker (green), and the filamentous actin stained by BODIPY TR-X phallacidin (red). 綠色熒光染料標記的微管抗體特異性結(jié)合紡錘體，藍色是即將分離進入兩個子細胞的染色體 成纖維細胞固定后用熒光抗體進行染色的顯微照片展示線粒體（綠色

10、）和細胞骨架的微管（紅色）在細胞中的分布在細胞生物學與分子生物學領(lǐng)域中，來自水母的綠色熒光蛋白基因常被用作為一個報告基因(reporter gene)。 將GFP基因與待測基因融合，在細胞內(nèi)表達，可以通過熒光顯微鏡觀察蛋白在活細胞內(nèi)動態(tài)變化?；畹墓壟咛サ臒晒怙@微照片，胚胎細胞表達由GFP和一種驅(qū)動蛋白相關(guān)的馬達分子組成的融合蛋白。GFP蛋白的位置顯示蛋白是胚胎細胞有絲分裂紡錘體和中心體的一部分。 日本科學家下村修、美國科學家馬丁沙爾菲和美籍華裔科學家錢永健因在發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白方面做出貢獻而獲得2008年諾貝爾化學獎。 4 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)20世紀50年代后期發(fā)明，多技術(shù)的集合。物

11、鏡和聚光鏡同時聚焦到同一點上（共焦點），可以自動改變觀察的焦平面，通過“光學切片”獲得一系列細胞不同切面上的圖像，經(jīng)疊加后重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。比普通熒光顯微鏡成像更清晰，分辨率更高。在研究亞細胞結(jié)構(gòu)與組分的定位及動態(tài)變化應(yīng)用廣泛。共聚焦顯微鏡及其顯微圖像Figure 3-8. Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stai

12、ned with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell

13、 in the embryo. 共聚焦顯微鏡拍攝的紫茉莉花的雄蕊5 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（現(xiàn)代分子細胞生物學技術(shù)之一，用于蛋白質(zhì)相互作用的鑒定）檢測活細胞中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有利工具，可以檢測兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測系統(tǒng)方法是將兩種蛋白分別與CFP（ cyan fluorescent protein）,YFP（ yellow fluorescent protein ）融合表達，通過檢測CFP熒光強度的損失量確定兩個蛋白是否相互作用。如果發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，說明兩個蛋白的距離在10nm的范圍內(nèi)，一般可以認定有相互作用。6 熒光漂白恢復技術(shù)（現(xiàn)代分子

14、細胞生物學技術(shù)之一，用于生物膜組分的動力學研究）熒光光漂白（FRAP）技術(shù)可進行生物膜脂質(zhì)分子側(cè)向擴散的研究，胞間通訊的研究，胞漿及細胞器內(nèi)小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移性的觀測等。 利用熒光分子的耦聯(lián)，檢測活細胞表面或內(nèi)部的分子運動以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動態(tài)變化率的大小。能夠獲得蛋白質(zhì)運動的定性結(jié)果，還可以得到擴散常數(shù)、蛋白移動率等定量信息。FRAP結(jié)果可以說明任何類型的熒光分子運動情況，例如：是被動的還是主動的?；謴蜁r間則表明了運動的速度。 藍色：無關(guān)細胞對照組 綠色：同一細胞對照組 紅色：光漂白組（二）、電子顯微鏡技術(shù)分辨率更高，1932年Ruska制成。與光鏡的基本區(qū)別：構(gòu)成上：光源為電子束（小于0.1

15、nm），使用電磁透鏡，鏡筒中要求高真空，圖像通過熒光屏觀察。分辨率上：最高0.2nm，只能在電子顯微鏡下觀察到的結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（超微結(jié)構(gòu)）。實際放大倍數(shù)為4500倍時，由光鏡和電鏡拍攝的圖像中所含信息的比較（a）1um厚的骨骼肌組織在光鏡油鏡下拍攝的圖片（b）0.025um厚的同樣組織切片在相同倍數(shù)的電鏡下觀察的結(jié)果，分辨率增加1-200倍透射電子顯微鏡（transmission electron microscope,TEM） 利用透過樣品的電子形成圖像，在觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)方面應(yīng)用廣泛。掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope, SEM） 利用樣品表面反彈

16、的電子成像，主要用于觀察物體的表面結(jié)構(gòu)。透射電鏡及其圖像1 透射電子顯微鏡 放大倍數(shù)在1000-250000倍之間，分辨極限為35埃。 TEM電鏡制樣技術(shù)：(1)超薄切片技術(shù):厚度40-50nm 固定包埋切片染色 Figure 3-19. Diagram of the copper grid used to support the thin sections of a specimen in the transmission electron microscope. Thin sectionsFigure 3-20. Electron micrograph of a root-tip cell

17、 stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen. Figure 3-21. Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme (nucleotide diphosphatase) in the Golgi appar

18、atus. A thin section of the cell was incubated with a substrate that formed an electron-dense precipitate upon reaction with the enzymeFigure 3-63. Immunogold electron microscopy. Electron micrographs of an insulin-secreting cell in which the insulin molecules have been labeled with anti-insulin ant

19、ibodies bound to tiny colloidal gold spheres. Most of the insulin is stored in the dense cores of secretory vesicles; in addition, some cores are being degraded in lysosomes.免疫電鏡技術(shù)(2) 冷凍超薄切片技術(shù)可以保存可溶性物質(zhì)和生物大分子的活性（尤其是酶），能夠在分子水平上研究細胞的超薄結(jié)構(gòu)。 樣品放置在液態(tài)丙烷（-42）或液氦（-273 ）冷卻的金屬塊上，快速冷凍，冰晶沒有時間生長到明顯破壞細胞結(jié)構(gòu)的程度。 冷凍切片制

20、備快速，在臨床上用于切除組織的惡性或良性的鑒定。(3) 冷凍蝕刻電鏡技術(shù) 通過樣品迅速冷凍和低溫下斷裂，觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。樣品可不經(jīng)包埋和固定處理。冷凍斷裂復型形成的過程斷裂蝕刻投影和復型氟利昂從正上方垂直在金屬層上沉積碳在斷裂面上沉積重金屬Figure. Freeze-fracture electron micrograph of the thylakoid membranes from the chloroplast of a plant cell. These membranes, which carry out photosynthesis, are stacked

21、 up in multiple layers. The largest particles seen in the membrane are the complete photosystem II-a complex of multiple proteins. Freeze-Fracture and Freeze-Etch Electron Microscopy 圖 18.10 深度蝕刻。原生動物四膜蟲纖毛軸絲的電鏡照片。（4）負染色技術(shù)： 負染色是用重金屬，如磷鎢酸或醋酸雙氧鈾，對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進行染色，吸去多余染料，樣品經(jīng)自然干燥后，整個載網(wǎng)上都鋪上了一層重金屬鹽，從而襯托出樣品的精細

22、結(jié)構(gòu)。投影的原理金屬沉積在面對金屬絲的顆粒表面，顆粒背面和陰影部分則沒有。電鏡下觀察投影部分表現(xiàn)亮，被金屬覆蓋的部分則暗。樣品具有極好的反差，產(chǎn)生三維圖像效果鉑絲蒸發(fā)真空容器樣品架觀察分離顆粒的另一種技術(shù)是使物體形成投影圖 18.8 負染色和金屬投影樣品的例子（a）以磷鎢酸鉀負染色后的煙草脆裂病毒的電鏡照片（b）用鉻投影的電鏡照片2 掃描電子顯微鏡：主要觀察樣品表面的形貌特征。制樣不需要切片和染色。為防止樣品在干燥中變形，常用CO2臨界點干燥法，樣品觀察前要用鍍金（一般是金或金-鈀合金）的方法使標本導電。觀察樣品的大小范圍從病毒到昆蟲的頭部，一般放大為15-150000倍，分辨率3nm。掃描電

23、鏡及其圖像Figure 3-23. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For comparison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microsco

24、py (C). Figure 3-32. Cells in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish.圖 18.11 掃描電鏡技術(shù)。（a）T4噬菌體（x275 000）（b）昆蟲頭部（x40）的掃描電鏡照片3 掃描隧道顯微鏡 （scanning tunnel microscpoe,STM） 1986年獲諾貝爾物理學獎，用于觀察大分子、生物膜和病毒等，在納米水平探索微觀世界物質(zhì)表面形貌。掃描隧道顯微鏡納米團簇“溴原

25、子” 二、細胞組分的分析方法 細胞的分離技術(shù)：分離特定類型細胞 亞細胞組分的分離技術(shù)：分離特定的細胞器或組分 細胞化學技術(shù)：顯示鑒定大分子 免疫細胞化學技術(shù)：特異蛋白的定位和定性 原位雜交技術(shù)：特定核酸序列的定位和定性 放射自顯影技術(shù)：標記的生物大分子定位、定量以及大分子動態(tài)示蹤1 細胞的分離技術(shù)：（1）流式細胞技術(shù)（flow cytometer,FCM）： 從組織中分選相對純化細胞的方法，利用了熒光染料耦聯(lián)的抗體標記細胞，通過FCM分選已標記和未標記的細胞，依據(jù)的是細胞內(nèi)發(fā)熒光的DNA含量不同，或者細胞表面熒光強度不同的特點。 該技術(shù)廣泛用于生物大分子的定量，細胞周期分析，細胞表面抗原、受體

26、、染色體、核質(zhì)比例、活細胞分類純化等研究中。Figure 3-31. A fluorescence-activated cell sorter. When a cell passes through the laser beam, it is monitored for fluorescence. Droplets containing single cells are given a negative or positive charge, depending on whether the cell is fluorescent or not. The droplets are then d

27、eflected by an electric field into collection tubes according to their charge. Note that the cell concentration must be adjusted so that most droplets contain no cells and flow to a waste container together with any cell clumps. The same apparatus can also be used to separate fluorescently labeled c

28、hromosomes from one another, providing valuable starting material for the isolation and mapping of genes. （2 ）密度梯度離心法分離細胞： 通過離心溶液形成密度梯度，以維持重力的穩(wěn)定性來抑制對流。 密度梯度離心純化：介質(zhì)由連續(xù)的密度梯度組成，各種顆粒到達與自身密度一致的區(qū)域，形成一條區(qū)帶。2 亞細胞組分的分離技術(shù)：通常是用低滲、超聲、研磨、勻漿或凍融的方法將細胞裂解，然后通過差速離心（differential centrifugation）使各種亞組分分開。不同組分的沉降率依據(jù)大小和形狀的

29、不同，以沉降系數(shù)(S)表示。 The technique of differential centrifugationStep-by-step procedure for the purification of organelles by differential centrifugation.S=(dx/dt)/2x =110-13sec.Figure 3-35. Cell fractionation by centrifugation. Repeated centrifugation at progressively higher speeds will fractionate homog

30、enates of cells into their components. In general, the smaller the subcellular component, the greater is the centrifugal force required to sediment it. Typical values for the various centrifugation steps referred to in the figure are low speed: 1,000 times gravity for 10 minutes medium speed: 20,000

31、 times gravity for 20 minutes high speed: 80,000 times gravity for 1 hour very high speed: 150,000 times gravity for 3 hours 通過密度梯度離心，可以將分子量小的核酸或蛋白質(zhì)進一步分離純化出來。密度梯度離心常用的介質(zhì)有蔗糖、聚蔗糖、氯化銫。 速度沉降：分離密度相近大小不同的組分 等密度沉降：分離不同密度的細胞組分，更靈敏 例如：15N標記大腸桿菌DNA，用氯化銫密度梯度離心的方法直接證明了DNA的半保留復制。速率沉降分離不同大小的DNA分子50000rpm，5h根據(jù)堿基組成

32、差異用平衡沉降法分離DNA分子分級分離b所得到的管中的內(nèi)含物密度梯度離心的流程3 細胞化學技術(shù)基于細胞內(nèi)的某些成分可以和某些化學試劑相結(jié)合或呈特殊反應(yīng)，在細胞內(nèi)或表面形成有色沉淀物或結(jié)合物而顯示細胞的結(jié)構(gòu)和成分。DNA的顯示：Feulgen反應(yīng)多糖的顯示：過碘酸雪夫（PAS）反應(yīng)脂類的顯示：四氧化鋨或蘇丹III酶的顯示：通常將新鮮標本采用快速冷凍切片， 盡可能保持其活性，然后將樣品與相應(yīng)底物進行共孵育。不同的酶有不同的顯示方法。4 免疫細胞化學技術(shù)在細胞水平研究特定的蛋白質(zhì)的定位和定性，利用抗體的抗原特異性識別結(jié)合細胞內(nèi)特定的蛋白質(zhì)，再通過第二抗體的結(jié)合，使信號加強。最為敏感的增強信號的方法是

33、用結(jié)合于第二抗體的酶作為標記分子。例如：熒光染料用于熒光顯微鏡（免疫熒光技術(shù)）、辣根過氧化物酶用于光鏡或電鏡、膠體金顆粒用于電鏡（免疫電鏡技術(shù)）、堿性磷酸酶用于生化檢測。臨床上的利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的敏感性可以檢測妊娠或各種感染。Figure 3-64. Indirect immunocytochemistry. The method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody. The seconda

34、ry antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readily detectable. Commonly used marker molecules include fluorescein or rhodamine dyes, the enzyme horseradish peroxidase or colloidal gold spheres, and the enzymes alkaline phosphatase or peroxidase. Figure 3-57. Visualizing int

35、racellular Ca2+ concentrations using a fluorescent indicator. The branching tree of dendrites of the Purkinje cell in the cerebellum receives more than 100,000 synapses from other neurons. The output from the cell is conveyed along the single axon seen leaving the cell body at the bottom of the pict

36、ure. This image of the intracellular calcium concentration in a single Purkinje cell was taken using a low-light camera and the Ca2+-sensitive fluorescent indictor fura-2. The concentration of free Ca2+ is represented by different colors, red being the highest and blue the lowest. (Courtesy of D.W.

37、Tank et al.) Figure 3-58. Fluorescent analogue cytochemistry. Fluorescence micrograph of the leading edge of a living fibroblast that has been injected with rhodamine-labeled tubulin. The microtubules throughout the cell have incorporated the labeled tubulin molecules. Thus individual microtubules c

38、an be detected and their dynamic behavior followed using computer-enhanced imaging, as shown here. Although the microtubules appear to be about 0.25 m thick, this is an optical effect; they are, in reality, only one-tenth this diameter. (Courtesy of P. Sammeh and G. Borisy.)5 原位雜交技術(shù)原位雜交（in situ hybr

39、idization）是采用標記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體或細胞中位置的方法。首先在光鏡水平上發(fā)展起來，又出現(xiàn)了熒光原位雜交（熒光素標記探針在熒光顯微鏡下觀察）、電鏡原位雜交（生物素等小分子標記探針，通過檢測抗生物素抗體相連的膠體金顆粒顯示出來）。Figure 7-20. In situ hybridization for RNA localization in tissues. Autoradiograph of a section of a very young Drosophila embryo that has been subjected to in situ h

40、ybridization using a radioactive DNA probe complementary to a gene involved in segment development. The probe has hybridized to RNA in the embryo, and the pattern of autoradiographic silver grains reveals that the RNA made by the gene (ftz) is localized in alternating stripes across the embryo that

41、are three or four cells wide. At this stage of development (cellular blastoderm), the embryo contains about 6000 cells. (E. Hafen et al, Cell 37:833-841, 1984.) Tracing and Assaying Molecules Inside Cells6 放射自顯影技術(shù)利用放射性同位素的電離輻射對乳膠的感光作用，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究的細胞化學技術(shù)，能夠?qū)ι锎蠓肿舆M行動態(tài)研究和追蹤。主要步驟：同位素標記的生物大分子前

42、體的摻入和細胞內(nèi)同位素所在位置的顯示。 3H-TdR研究DNA; 3H-U研究RNA; 35S標記Met和Cys，研究蛋白質(zhì)將脈沖示蹤實驗和放射自顯影術(shù)結(jié)合，對闡明細胞中的過程，例如分泌蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細胞外的過程十分有效。 脈沖示蹤是將放射性物質(zhì)以脈沖形式加入樣品，經(jīng)極短暫處理后，將其洗去，以非放射性分子代替。將染色體制作技術(shù)和放射自顯影技術(shù)結(jié)合，可以觀察染色體復制的動態(tài)變化、細胞周期的測定、鑒別早復制或晚復制的染色體。 放射自顯影的操作程序標記培養(yǎng)固定脫水包埋切片放射性敏感的液態(tài)乳膠暗盒儲存顯影Figure 3-51. Electron-microscopic autoradiography

43、. The results of a pulse-chase experiment in which pancreatic beta cells were fed 3H-leucine for 5 minutes followed by excess unlabeled leucine (the chase). The amino acid is largely incorporated into insulin, which is destined for secretion. After a 10-minute chase the labeled protein has moved fro

44、m the rough ER to the Golgi stacks (A), where its position is revealed by the black silver grains in the photographic emulsion. After a further 45-minute chase the labeled protein is found in electron-dense secretory granules (B).(Courtesy of L. Orci, from Diabetes 31:538-565) 光學顯微鏡和電子顯微鏡放射自顯影（a）搖蚊屬

45、昆蟲多線染色體的光學顯微鏡放射自顯影照片，顯示了在染色體的膨大區(qū)，大量的3H尿嘧啶核苷插入RNA中。（b）骨髓細胞電子顯微鏡放射自顯影照片。箭頭指出黑色銀顆粒顯示了硫酸鹽摻入到高爾基復合體的部位。三、細胞培養(yǎng)、細胞工程等相關(guān)技術(shù)（一）、細胞培養(yǎng)： 屬于生命科學研究的基本實驗技術(shù)，涉及： 原核細胞培養(yǎng)（細菌） 真核單細胞培養(yǎng)（酵母） 動物細胞培養(yǎng) 植物細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)的用途廣泛，不僅可以研究細胞本身的生物學特性，還可改變培養(yǎng)條件、用特殊的理化因子和生物因子處理，觀察細胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、行為、甚至基因的變化，從而得到細胞生長、分化、癌變、凋亡、衰老以及其他的病變規(guī)律。1 動物細胞培養(yǎng)任何動物細胞的培

46、養(yǎng)都需從機體獲取細胞開始，因此體外培養(yǎng)細胞包括：（1）原代細胞（primary culture cell） 從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞，不同類型的細胞體外培養(yǎng)的難度差別很大。 取材分散細胞（酶消化處理和細胞篩濾過）-制備單細胞懸液-提供合適的培養(yǎng)環(huán)境（營養(yǎng)、溫度、pH、血清、CO2等）-細胞貼壁進行有絲分裂形成細胞單層(2)傳代細胞（subculture cell） 適應(yīng)在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞。 包括兩種類型： 有限細胞系（finite cell line）： 體外培養(yǎng)傳代次數(shù)有限的細胞（約50代）。 永生細胞系（infinite cell line）： 傳代中發(fā)生遺傳突變，具有了

47、癌細胞的特點，有可能無限制的傳代培養(yǎng)下去。體外培養(yǎng)細胞可以分成貼壁型和懸浮型，一般不能保持體內(nèi)原有的細胞形態(tài)。貼壁型有兩種基本形態(tài)：成纖維樣細胞和上皮樣細胞；懸浮型則呈球形。2 植物細胞培養(yǎng)（1）單倍體細胞培養(yǎng)： 花藥離體培養(yǎng)： 雄性生殖細胞-胚狀體-單倍體植株 愈傷組織培養(yǎng)： 誘導愈傷組織-分化出芽和根-完整植株（2）原生質(zhì)體培養(yǎng)： 植物體細胞-纖維素酶消化細胞壁-原生質(zhì)體-培養(yǎng)和誘導分化-植株（二）、細胞工程： 在細胞水平的生物工程，涉及的技術(shù)包括： 細胞培養(yǎng) 細胞分化的定向誘導 細胞融合 顯微注射1 細胞融合與細胞雜交技術(shù)： 細胞融合： 兩個或多個細胞融合成一個雙核或多核細胞，不經(jīng)有性生

48、殖過程而得到雜種細胞的方法。 方法： 病毒介導（滅活的仙臺病毒） 化學介導（聚乙二醇） 電融合（高壓電脈沖）基因型不同的細胞形成的融合細胞叫做異核融合細胞，在培養(yǎng)過程中會發(fā)生染色體丟失，例如：人鼠雜交細胞。細胞融合技術(shù)始于20世紀50年代末，60年代后期發(fā)明了只讓雜種細胞存活并傳代的技術(shù)。Figure 3-33. The production of hybrid cells. Human cells and mouse cells are fused to produce heterocaryons, which eventually form hybrid cells. These part

49、icular hybrid cells are useful for mapping human genes on specific human chromosomes because most of the human chromosomes are quickly lost in a random manner, leaving clones that retain only one or a few. The hybrid cells produced by fusing other types of cells often retain most of their chromosome

50、s. 2 單克隆抗體技術(shù)：抗體：機體對抗原刺激應(yīng)答所產(chǎn)生的免疫球蛋白，對相應(yīng)的抗原有特異反應(yīng)。是B淋巴細胞分化來的漿細胞合成并分泌的。傳統(tǒng)抗體的制備： 對動物（兔或山羊）反復注射抗原-數(shù)周后抽血-處理全血-除去細胞和凝血因子-獲得抗血清-測試抗血清的抗體效價-純化抗體 類型： 多克隆抗體：眾多B淋巴細胞對一種抗原的不同抗原決定簇應(yīng)答而合成的多種免疫球蛋白，為不均質(zhì)抗體。 單克隆抗體：從單克隆雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體，為同一類或同一亞類的免疫球蛋白，其獨特型和恒定區(qū)完全相同，具有高度的特異性。單克隆抗體技術(shù)是1975年Milstein和Kohler建立的，并于1984年獲諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。原理： B淋巴細胞的免疫（對8-12周齡小鼠進行抗原注射）-分離免疫后小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合HAT培養(yǎng)液篩選雜交瘤細胞具有穩(wěn)定生長和抗體分泌功能的雜交瘤細胞的克隆化收獲單克隆抗體融合后的雜交瘤細胞具有親本的特性，既可以分泌抗體，又可以在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)無限增殖。 Figure 3-65. Preparation of hybridomas that secrete mo