醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)器材原理及應(yīng)用 2014年(共12頁)

1、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)器材原理及應(yīng)用（2014）第一章1何謂衛(wèi)生(wishng)技術(shù)、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(jsh)？衛(wèi)生(wishng)技術(shù)：用于衛(wèi)生保健和醫(yī)療服務(wù)系統(tǒng)的特定知識(shí)體系，包括藥物、器械設(shè)備、衛(wèi)生材料、醫(yī)療方案、技術(shù)程序、后勤支持系統(tǒng)和行政管理組織。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)：用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)(研究、教學(xué)、科技創(chuàng)新、檢驗(yàn)等)的實(shí)驗(yàn)材料（試劑與材料）、儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)程序及其相關(guān)知識(shí)和組織管理技術(shù)、支持技術(shù)體系。2現(xiàn)代衛(wèi)生裝備技術(shù)與醫(yī)學(xué)發(fā)展間的相互作用主要特征體現(xiàn)在哪幾方面？4個(gè)正向效應(yīng) 1個(gè)負(fù)向效應(yīng)正向效應(yīng) 效應(yīng)1. 醫(yī)學(xué)裝備技術(shù)推動(dòng)著醫(yī)學(xué)進(jìn)步效應(yīng)2. 新技術(shù)促進(jìn)了新學(xué)科的形成效應(yīng)3. 技術(shù)的擴(kuò)布改變了某些學(xué)科的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)

2、及格局效應(yīng)4. 技術(shù)牽動(dòng)著某些醫(yī)學(xué)程序改革負(fù)向效應(yīng)特征：技術(shù)發(fā)展與衛(wèi)生資源的動(dòng)員形成矛盾第二章1. 常用的組織細(xì)胞破碎的方法有哪幾種？物理法:機(jī)械法: 研磨、(搗碎)、勻漿、超聲、擠壓；反復(fù)凍溶(-15-20，冰箱等制冷環(huán)境)、急熱驟冷化學(xué)及生化法：自溶、酶解、化學(xué)滲透（表面活性劑處理、有機(jī)溶媒等，細(xì)菌、細(xì)胞）2. 試舉兩種組織細(xì)胞破碎儀器，簡述其主要通過何物理作用？主要用途？（1）研磨式組織細(xì)胞破碎儀 物理作用：碾壓、機(jī)械切力。目的：制備組織漿液，提取存在于組織、細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)或?yàn)榧?xì)胞破碎做準(zhǔn)備。（2）超聲細(xì)胞破碎機(jī) 物理作用：超聲振動(dòng)空穴效應(yīng)沖擊波和剪切力。目的：細(xì)胞破碎。3. 超濾要解決常

3、規(guī)過濾所遇到的主要技術(shù)難題是什么？并說明解決這一難題主要從哪三個(gè)因素考慮？目前，實(shí)驗(yàn)室常的超濾方法有幾種。試舉出倆種？濃度極化：大分子聚集濃度梯度濃度極化次級(jí)膜阻礙選擇性分離，流速 三個(gè)因素：1.加大壓力-凝膠層；2.攪動(dòng)；3.切向流。 超濾方法：4種 真空透析超濾、離心濃縮超濾、加壓攪拌室超濾、切向流系統(tǒng)超濾。4. 減壓蒸發(fā)時(shí)，壓力溫度直線圖的應(yīng)用？應(yīng)用：（1）某種液體常壓沸點(diǎn)為100，希望在20下蒸發(fā)，兩者連線得出需控制減壓為50 mmHg。（2）減壓：通過系統(tǒng)連真空泵完成。5. 真空(zhnkng)冷凍干燥的基本定義。真空(zhnkng)冷凍干燥，也稱升華干，是將材料冷凍，使其含有的水份

4、變成冰塊，然后在真空下使冰升華而達(dá)到干燥(gnzo)目的。6如何根據(jù)待凍干樣品的共晶點(diǎn)設(shè)置凍干條件（凍干溫度，安全溫度）？在升華過程中，物料溫度應(yīng)維持在低于而又接近共融點(diǎn)的溫度。在干燥過程中樣品的溫度只由真空度決定, 而不受擱板溫度或外界溫度控制。在干燥的初始階段, 根據(jù)水的冰上蒸氣壓曲線，樣品溫度和真空度成比例, 樣品的溫度與擱板的溫度無關(guān)。在干燥過程中重要的一點(diǎn)是使樣品不能融化, 因而干燥的溫度必須低于共晶點(diǎn)溫度1015 。為保證樣品在最大的安全下干燥, 有必要使之運(yùn)行在安全壓力下. 如果干燥室內(nèi)的真空度上升, 達(dá)到安全壓力, 擱板將停止加熱, 升華過程變緩, 因而防止了樣品的融化。安全溫

5、度應(yīng)低于共晶點(diǎn)溫度7 或 5，根據(jù)冰上蒸氣壓曲線可得出安全真空度。7.離心技術(shù)的基本定義，常用離心制備技術(shù)有哪兩種？離心(Centrifugation)：是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及被離心樣品物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差別進(jìn)行分離、濃縮、提取制備生物樣品，分析測(cè)定生物大分子分子量及純度的重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)。差速離心和密度梯度離心8.簡述差速離心的基本概念？利用離心樣品組份中不同S值的顆粒沉降速度不同，經(jīng)一定速度一定時(shí)間離心而先后沉淀達(dá)到分離效果。在此過程中樣品往往被分離為沉淀物和上清液兩部分。9. 如何將文獻(xiàn)報(bào)道的離心力（或轉(zhuǎn)速），時(shí)間，經(jīng)計(jì)算轉(zhuǎn)換到實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有相應(yīng)離心機(jī)上？S = K/t 或t = K

6、/S T2 = T1 K1/K2已知時(shí)間和RCF轉(zhuǎn)換：t1RCF1 = t2RCF2 t2 = t1RCF1/RCF210. 長期使用超低溫冰箱，要定期進(jìn)行的是哪兩項(xiàng)保養(yǎng)措施？定期除塵、除霜。第三章1. 細(xì)胞培養(yǎng)的定義？ 組織細(xì)胞培養(yǎng)：從動(dòng)物活體內(nèi)取出組織或經(jīng)分離得到的細(xì)胞于模擬體內(nèi)生理生化環(huán)境等特定體外條件下進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存并生長的過程。細(xì)胞培養(yǎng)(Cell Culture) ：是把組織用機(jī)械或消化辦法分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，而后進(jìn)行培養(yǎng)生長。2. 細(xì)胞培養(yǎng)的必要條件(b yo tio jin)是什么？必要條件(b yo tio jin)：無菌 溫度 pH 滲透壓 體外培養(yǎng)細(xì)胞生存所需基本物

7、質(zhì)(wzh) 附著底物 3.CO2培養(yǎng)箱的內(nèi)部工作環(huán)境應(yīng)符合的條件。一般說來培養(yǎng)箱的內(nèi)部工作環(huán)境中下列因素應(yīng)符合一定的條件：溫度 相對(duì)濕度 CO2濃度 O2濃度（選配） 無菌條件4. 在CO2培養(yǎng)箱中，CO2的主要作用是什么？CO2調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH的化學(xué)反應(yīng)式。CO2作用：既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需的成分，它主要與維持培養(yǎng)基的PH有直接關(guān)系。反應(yīng)式：CO2+H2OH2CO35. 凈化工作臺(tái)分為哪兩類？簡述水平風(fēng)式和垂直風(fēng)式凈化工作臺(tái)的區(qū)別和優(yōu)缺點(diǎn)？分類：水平風(fēng)式和垂直風(fēng)式區(qū)別及優(yōu)缺點(diǎn)：（1）垂直風(fēng)式: 氣流是從上至下流動(dòng)，在操作者前方形成了一個(gè)風(fēng)屏，但由于氣流負(fù)壓作用裹夾氣體進(jìn)入。（2）水

8、平風(fēng)式: 凈化空氣是經(jīng)臺(tái)上方和臺(tái)內(nèi)側(cè)水平吹出，氣流向外移動(dòng)，不易混入外界氣體，但操作有害物質(zhì)時(shí)對(duì)操作者構(gòu)成不利。6. 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式？貼附生長 懸浮生長7. 貼附培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程？生長過程：游離期、貼壁期、潛伏期、對(duì)數(shù)生長期、停止期（平臺(tái)期）8接觸抑制和密度抑制定義？接觸抑制：正常細(xì)胞存在連續(xù)不間斷活動(dòng)（移動(dòng)），其外周呈現(xiàn)出特征性皺褶樣活動(dòng)，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞圍繞致無處可去時(shí)發(fā)生細(xì)胞接觸，細(xì)胞不再移動(dòng)，接觸區(qū)域細(xì)胞膜皺褶樣活動(dòng)停止。密度抑制：細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代

9、謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。9.冷凍(lngdng)速率(sl)和復(fù)溫速率的定義？冷凍速率(sl)：是指降溫速度，它是影響活細(xì)胞能否被冷凍到一個(gè)能永久保存溫度主要因素。不同的冷凍速度會(huì)使細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生不同的生理變化，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。復(fù)溫速率：是指細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，復(fù)溫速率不當(dāng)也會(huì)降低冷凍存活率。一般來說復(fù)溫速度越快越好，37水浴中，1-2分鐘內(nèi)要完成復(fù)溫。10. 細(xì)胞污染物檢測(cè)包括哪些？細(xì)菌和真菌污染檢測(cè)：a肉眼直接觀察法 b培養(yǎng)檢查法 c顯微鏡觀察法支原體檢測(cè)：a相差顯微鏡觀察法 b Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法 c

10、DNA熒光染色法病毒檢測(cè)：a致細(xì)胞病變效應(yīng)或集落檢測(cè) b血細(xì)胞吸附試驗(yàn) c雞胚接種細(xì)胞間交叉污染11. 細(xì)胞工程學(xué)概念概念：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，通過類似工程學(xué)的步驟，在細(xì)胞或細(xì)胞器水平上按照人們的意愿來改造細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，已獲得新的生物物種、品種或特種細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合性技術(shù)。12. 例舉3-4個(gè)細(xì)胞融合技術(shù)。仙臺(tái)病毒(HvJ)誘導(dǎo)法 聚乙二醇(PEG)化學(xué)誘導(dǎo)法 細(xì)胞電融合技術(shù) 激光誘導(dǎo)法 高通量細(xì)胞融合芯片 空間細(xì)胞融合技術(shù) 離子束融合技術(shù)13. 例舉2個(gè)染色體分離技術(shù)。微細(xì)玻璃針切割法 顯微激光切割法14.什么是細(xì)胞拆合工程？細(xì)

11、胞質(zhì)工程，又稱細(xì)胞拆合工程，是通過物理或化學(xué)方法將細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分開，再進(jìn)行不同細(xì)胞間核質(zhì)的重新組合，重建成新細(xì)胞?？捎糜谘芯考?xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的關(guān)系的基礎(chǔ)研究和育種工作。 15. 無血清培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn)？優(yōu)點(diǎn)：（1）可避免 HYPERLINK /yp/product-list-636.html 血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。（2）避免 HYPERLINK /yp/product-list-636.html 血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和 HYPERLINK /yp/product-list-636.html 血清源性污染。（3）避免 HYPERLINK /yp/product-list

12、-636.html 血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響。（4）有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。（5）可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。缺點(diǎn)：（1）不同細(xì)胞系對(duì)無血清培養(yǎng)液的適應(yīng)性各不相同缺乏廣泛的通用性（2）價(jià)格高，不適宜高密度培養(yǎng)（3）馴化過程長且克隆不穩(wěn)定（4）不能維持(wich)細(xì)胞無限生長16. 動(dòng)物(dngw)細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)?（1）絕大多數(shù)為哺乳類動(dòng)物細(xì)胞（2）動(dòng)物細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)(yngyng)的要求較高（3）動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性較差，生長緩慢，培養(yǎng)時(shí)間較長（4）對(duì)環(huán)境條件要求嚴(yán)格 pH CO2（5）各種污染的防治問題（6）長時(shí)間培養(yǎng)使原有的細(xì)胞功能、形態(tài)及分化特征發(fā)生變化或變異17大規(guī)模

13、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式有哪些？分批式培養(yǎng) 流加式培養(yǎng)（ 單一補(bǔ)料分批式培養(yǎng)、 反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)） 半連續(xù)式培養(yǎng) 連續(xù)式培養(yǎng) 灌流式培養(yǎng)第四章1. 在使用普通透射光正置顯微鏡做明視場(chǎng)觀察時(shí)，怎樣計(jì)算光學(xué)顯微鏡的分辨率？公式：D =/ NA 波長(nm)，NA 數(shù)值孔徑2.何謂光學(xué)顯微鏡的有效放大？有效放大：所用物鏡NA值的5001000 X3. 在用光學(xué)顯微鏡觀察和照相時(shí)，如何調(diào)置聚光鏡NA值與物鏡NA值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，分別追求的主要效果是什么？NA大，光柵疏 主極大連多個(gè)次極大（明 暗） NA小，光柵密 主極大僅各兩2個(gè)次極大（1）增加反差分辨（2）不同倍率物鏡有不同的NA值（3）需與聚光鏡NA

14、值作對(duì)應(yīng)調(diào)整4. 提高光學(xué)顯微鏡分辨率的主要措施？（1）增大物鏡孔徑角；（2）降低光源波長的值；（3）增大值提高NA ；（4）增加鏡像的反差：調(diào)整好聚光鏡NA與物鏡NA的對(duì)應(yīng)比例；調(diào)節(jié)視場(chǎng)光闌，屏蔽雜散光。5簡述相差顯微鏡的原理，相差裝置的調(diào)整主要目的及要達(dá)到的光學(xué)效果是什么，需借助的主要工具是什么？基本原理：利用被檢體的光程(折射率與厚度的乘積)之差，有效利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不能分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?。相?xin ch)裝置(zhungzh)調(diào)整(tiozhng)的主要目的：調(diào)整聚光鏡相差環(huán)的環(huán)狀光闌成像與相差物鏡的相板共軛面完全吻合。環(huán)狀光闌：造成光程不同，偏斜/衍射。產(chǎn)生直

15、射光及衍射光。相(位)板： 共軛面(半透明環(huán)) 通過直射光，補(bǔ)償面(中間) 通過衍射光。達(dá)到的光學(xué)效果：兩光合成干涉振幅差的形成。需借助的主要工具：相板，相板上相位膜(涂氟化鎂)：+相板、-相板，分別用于推遲直射光和衍射光的相位。由于共軛面與補(bǔ)償面性質(zhì)不同 光線相位差、強(qiáng)弱不同 物鏡后透鏡聚合 干涉(振幅差)。6.顯微攝影的基本定義？.將顯微鏡視場(chǎng)中的微觀圖像記錄為放大圖像的技術(shù)。7. 什么是顯微操作系統(tǒng)？顯微操作技術(shù)包括什么？顯微注射的儀器組成？顯微操作系統(tǒng)：由倒置顯微鏡和顯微操作儀兩部分構(gòu)成.顯微操作儀包括密封的微量注射器,細(xì)塑料管和玻璃微吸管,整個(gè)系統(tǒng)都由液體(蒸餾水,硅油或石蠟油等)充

16、滿。 包括：細(xì)胞核移植 顯微注射 嵌合體技術(shù) 胚胎移植 顯微切割. 組成：(1).顯微拉針儀 (2)煅燒儀(微熔燈) (3)顯微磨針(尖)儀 (4)顯微操作系統(tǒng) (5)附助設(shè)備:解剖鏡, CO2培養(yǎng)箱, 超凈工作臺(tái)8.簡述顯微注射固定針的制作過程？(1)拉針儀拉制:調(diào)節(jié)拉針儀參數(shù)將毛細(xì)玻璃管拉成外徑適當(dāng)?shù)男」?2)斷開:在鍛燒儀鉑金絲或加熱絲的小玻璃滴上,在小管外徑為80100m處斷開(3)烤制:小管斷開后,調(diào)節(jié)微調(diào)使小管撞擊去掉尖細(xì)部分,然后把留下的吸管之?dāng)嗫诳拷鼰t的玻璃滴加熱,使之燒化,就可烤制成內(nèi)徑為2030m末端純圓的固定吸管。9.什么是超排卵？超排卵：為了獲得更多的胚胎，人們模擬體

17、內(nèi)發(fā)育成熟與排放的激素調(diào)節(jié)模式，通過注射不同的促性腺激素刺激暫時(shí)處于休止?fàn)顟B(tài)的卵母細(xì)胞進(jìn)入成熟發(fā)育期， 成熟后排放于輸卵管。由此可獲得比自然排卵時(shí)多得多的卵母細(xì)胞或胚胎，稱為超排卵。10.顯微注射轉(zhuǎn)染外源基因的優(yōu)缺點(diǎn)？優(yōu)點(diǎn)：目前建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物極為重要的方法：可直接用不含有原核載體DNA片段的外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移；外源基因的長度不受限制，可達(dá)100kb ；實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)比較短。缺點(diǎn)：(1)基礎(chǔ)費(fèi)用太高:顯微操作用的設(shè)備太昂貴,限制了大多數(shù)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。顯微操作的成功率與操作者的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)相關(guān)：注射微管質(zhì)量、注射位置、顯微鏡的光源強(qiáng)度、注射體積。(2)操作后胚胎的成活率低。(3)導(dǎo)入外源基因整合位點(diǎn)和

18、拷貝數(shù)無法控制；常導(dǎo)致插入位點(diǎn)附近宿主DNA 片段缺失、重組等突變，可造成動(dòng)物嚴(yán)重的生理缺陷。(4)每次只能注射有限的細(xì)胞數(shù)目。11. 影響轉(zhuǎn)染效率(xio l)的因素？影響外源基因表達(dá)的質(zhì)粒因素有哪些？影響轉(zhuǎn)染效率因素：傳代(chun di)次數(shù) 細(xì)胞融合率 支原體污染。 質(zhì)粒因素(yn s)：質(zhì)粒的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性。12. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的區(qū)別？瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-96小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)

19、果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，半乳糖苷酶等來幫助檢測(cè)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/10 4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。在加入選擇性試劑之前，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞至少要在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。這樣就使細(xì)胞有時(shí)間表達(dá)足量的蛋白使之能夠耐受選擇性試劑的作用。細(xì)胞于是在加有選擇性試劑的培養(yǎng)基中生長。那些未成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞即被殺死。而只有那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能

20、夠生長。13. 實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的三大主策略是什么？轉(zhuǎn)染技術(shù)主要是基于三種不同的策略來實(shí)現(xiàn) 1）利用運(yùn)送體分子，如磷酸鈣、 DEAE-（二乙胺乙基）右旋糖苷，陽離子脂質(zhì)體試劑和新復(fù)合組分的轉(zhuǎn)染試劑； 2）直接輸送，如電穿孔、基因槍和顯微注射 3）病毒載體。14. 激光捕獲顯微切割技術(shù)主要用于從實(shí)體組織中分離出的研究對(duì)象包括哪些？同質(zhì)細(xì)胞群、單個(gè)細(xì)胞甚至亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)15. 比較激光捕獲顯微切割技術(shù)與流式熒光細(xì)胞分選技術(shù)的優(yōu)劣？LCM是目前從組織或細(xì)胞單層分離亞群細(xì)胞的有效方法，同時(shí)實(shí)現(xiàn)將組織中每種細(xì)胞群作為研究對(duì)象，其分子表達(dá)譜會(huì)非常接近體內(nèi)狀態(tài)。LCM技術(shù)能夠使我們分離得到特異的目的細(xì)胞，而沒有周圍細(xì)胞

21、的污染。細(xì)微：研究對(duì)象可以達(dá)到m 級(jí)原位：在組織細(xì)胞原位取材，定位清楚、準(zhǔn)確同質(zhì)：保證獲得同質(zhì)研究對(duì)象結(jié)合：分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病理學(xué)研究16. 激光捕獲顯微切割前進(jìn)行免疫染色的意義。免疫染色：是在LCM之前進(jìn)行免疫組化或免疫熒光染色，增強(qiáng)在復(fù)雜組織中對(duì)目的細(xì)胞的鑒別能力，可以在形態(tài)上相似的細(xì)胞中選出在免疫表型上明顯(mngxin)不同的細(xì)胞，如B和T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)功能分類(fn li)后的細(xì)胞進(jìn)行分選。17. 利用激光捕獲顯微切割(qig)技術(shù)進(jìn)行GFP 標(biāo)記的活細(xì)胞篩選的目的。篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞群18. 什么是圖像數(shù)字化？簡述其基本步驟。利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析時(shí)，首先將可見圖像轉(zhuǎn)變成

22、數(shù)字圖像，稱為模擬圖像數(shù)字化?；静襟E為：抽樣、量化。抽樣就是把時(shí)間和空間上連續(xù)的圖像變成離散點(diǎn)集合的一種操作, 這些離散點(diǎn)即為抽樣點(diǎn), 稱為像素或像點(diǎn)。量化：把各個(gè)像素點(diǎn)的明暗程度變成灰度值的過程稱為量化。抽樣后各個(gè)像素點(diǎn)的明暗度即其灰度是連續(xù)量，把它離散化使其成為有限個(gè)整數(shù)值。8 位/像素，就有(28 ) 0 255個(gè)灰度級(jí)。16位/像素，就有（216 ）0 65535個(gè)灰度級(jí)。19. 顯微圖像分析的主要參數(shù)？整合平均光密度和面積比。20. 計(jì)算機(jī)免疫組化圖像分析的原理是什么？（1）利用專業(yè)的圖像分析軟件，可以迅速得到全面和精確的免疫組化圖像的量化結(jié)果。（2）免疫組化染色程度與抗原量存在著

23、很好的線性關(guān)系，好的免疫組化片能真實(shí)的反映抗原含量的多少，這是對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行光密度測(cè)量進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定量分析的基礎(chǔ)。21. 光密度的定義？（optical density,OD值）光密度的主要評(píng)價(jià)參數(shù)有哪些？光密度（optical density，OD值）是光學(xué)測(cè)量中的概念，定義為吸收光線物質(zhì)的光學(xué)密度，與該物質(zhì)的物理密度應(yīng)該是線性相關(guān)的。光密度主要評(píng)價(jià)參數(shù)：積分光密度和平均光密度。第五章1. PCR的主要步驟及相應(yīng)的溫度范圍？變性 95 退火 與Tm有關(guān) 延伸 722.簡要說明PCR實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)的基本要求？基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾

24、結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。 幾個(gè)要點(diǎn)：（1）引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)?yn wi)過長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行(jnxng)反應(yīng)。（2）引物序列(xli)在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。(3)引物3端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端

25、使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。(4)引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。(5)引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)。(6)G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G值較低（絕對(duì)值不超過9），而5端和中間G值相對(duì)較高的引物。引物的3端的G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。(7)引物二聚體及

26、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。(8)對(duì)引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。3.試述電泳上樣緩沖液成分及作用？Tris-Hcl；SDS；溴酚藍(lán)；甘油；-巰基乙醇SDS是保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致，減少電荷對(duì)電泳結(jié)果的影響；還原劑-巰基乙醇是讓二硫鍵處于斷開狀態(tài)，保證蛋白分子的線性；溴酚藍(lán)作用是指示上樣蛋白的跑膠時(shí)標(biāo)記的；甘油是增加上樣重量的，以免漂浮。4.常用的循環(huán)數(shù)與初始靶濃度之間的關(guān)系為？常用的循環(huán)數(shù)與初始靶濃度之間的關(guān)系為：靶分子數(shù) 循環(huán)數(shù)

27、3 105 20301.5 104 30351 103 35405 40455 .比較說明Southern,Northen,Western印跡（Blotting）應(yīng)用上的不同？DNA RNA 蛋白質(zhì)Southern Blotting和Northern Blotting是基于DNA和RNA分子之間堿基互補(bǔ)配對(duì)的特異性識(shí)別能力，而Western Blotting則基于抗原抗體之間特異的免疫反應(yīng)。Southern Blotting和Northern Blotting時(shí)使用帶有標(biāo)記（如同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記）的DNA或RNA探針去識(shí)別并結(jié)合到待檢測(cè)核酸上，然后直接顯影；而Western Blotting

28、時(shí)要先用待檢測(cè)蛋白的“一抗”結(jié)合到待檢測(cè)蛋白上，再用可識(shí)別“一抗”并偶聯(lián)了某種酶的“二抗去檢測(cè)”一抗“，最后通過顯色反應(yīng)的信號(hào)來顯示待檢測(cè)蛋白的存在與否及量的多少。 另外，Southern Blotting和Northern Blotting兩者比較容易混淆。這兩種技術(shù)最關(guān)鍵的區(qū)別在于待檢測(cè)核酸的屬性，如果被檢測(cè)的是DNA，則該技術(shù)就是Southern Blotting，其探針可以是DNA也可以是RNA；類似(li s)地，如果被檢測(cè)的是RNA，不管探針是RNA還是DNA，該方法就叫作Northern Blotting。6. 影響電泳遷移率的幾個(gè)(j )因素？（1）、樣品的物理性狀(xngzh

29、ung) （2）.支持物介質(zhì) （3）.電滲 （4）.電場(chǎng)強(qiáng)度 （5）.緩沖液離子強(qiáng)度 （6）.焦耳熱7什么叫變性？什么叫遷移率？通過加熱可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離，形成單鏈DNA，此即為DNA高溫?zé)嶙冃?。遷移率(又稱泳動(dòng)率)是帶電荷顆粒在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，單位時(shí)間內(nèi)在介質(zhì)中的遷移距離。8.PCR操作時(shí)應(yīng)注意把哪些區(qū)域分離？下列兩種工作區(qū)域應(yīng)隔離：A.PCR前 B. PCR后稱量試劑 PCR產(chǎn)物電泳配制緩沖液 PCR產(chǎn)物加工提取DNA 分析和測(cè)序PCR產(chǎn)物準(zhǔn)備PCR原液 儲(chǔ)備產(chǎn)物用于第二次擴(kuò)增準(zhǔn)備PCR9. 熒光定量PCR技術(shù)中的概念：CT值。PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到

30、設(shè)定的閾值時(shí)，所經(jīng)過擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。10. 簡述HMR技術(shù)。高分辨熔解曲線分析技術(shù)是根據(jù)DNA序列的長度，GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析，其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分。HRM是利用了特定的染料可以插入DNA雙鏈中的特性，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況記錄高分辨率熔解曲線，從而對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。11. 如PCR產(chǎn)物為200bp,可用何種電泳介質(zhì)檢測(cè)，如要想得到較好的分辨率，應(yīng)采用哪種電泳介質(zhì)檢測(cè)為宜？瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳12. 試述在SDS法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量中試劑(shj)SDS

31、的作用？SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度(nngd)的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。13. 按凝膠的形式(xngsh)，有哪幾種分離核酸的電泳方式?瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳14. 有302nm和360nm兩個(gè)波長的UV透射檢測(cè)儀，用于EB染色核酸電泳成像和切膠回收樣品時(shí)，分別應(yīng)選用哪個(gè)波長，為什么？短波254nm的紫外線是由核酸吸收后傳遞給EB，靈敏度較高，對(duì)核酸的損害作用最大，會(huì)造成核酸鏈斷裂或形成嘧啶二聚體，照射時(shí)間過長還會(huì)引起褪色效應(yīng)；300nm和360nm的紫外光主要由EB分子直接吸收，對(duì)核酸的斷鏈和嘧啶二聚體形成等效應(yīng)小，褪色反應(yīng)輕微，靈敏度為300nm 2