陳其軍CRISPRCasbasedtoolkit

1、ACRISPR/Cas-based Toolkit for Plant Multiplex Genome Editing, Multigene Interference, and Multigene Activation陳其軍中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物(shngw)學(xué)院植物科學(xué)系植物生理學(xué)與生物化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究技術(shù)交流(jioli)與分享共二十九頁基因組編輯工具發(fā)展歷史(lsh)與現(xiàn)狀基因組編輯（Genome editing）或基因組工程（genome engineering）或基因打靶（Gene targeting）歷史1993年前ZFN就已開始出現(xiàn)，迄今已發(fā)展了20多年才有今天的成就；2009

2、年底出現(xiàn)的TALEN似乎一夜之間呈現(xiàn)出取代ZFN的架勢(shì)；2012年底CRISPR/Cas已顯現(xiàn)出取代TALEN的巨大潛力，在2013年成為現(xiàn)實(shí)(xinsh)。榮譽(yù)2011年：ZFN， TALEN和Meganuclease2011年度方法（Nature Methods）2012年：TALEN 2012年十大突破（Science）2013年：CRISPR/Cas被認(rèn)為是諾貝爾獎(jiǎng)級(jí)別的成果，華人科學(xué)家張峰已因此獲得生物醫(yī)學(xué)大獎(jiǎng)?；蚪M編輯工具的應(yīng)用基因組巡航導(dǎo)彈，分子剪刀，DNA外科醫(yī)生定點(diǎn)突變，定點(diǎn)修飾（包括得到轉(zhuǎn)基因），轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因治療（如遺傳?。┕捕彭?2013年CRISPR/Cas研究(

3、ynji)論文Science：2篇（同時(shí)發(fā)表）Nature Biotech： 8篇【其中5篇（包括(boku)植物方面3篇）同時(shí)發(fā)表】；Cell：4篇Nature Methods：3篇Cell Research：4篇【其中植物方面2篇】PNAS：1篇共二十九頁 2013年植物(zhw)CRISPR/Cas研究論文Shan,Q.,Wang,Y.,Li,J.,Zhang,Y.,Chen,K.,Liang,Z.,Zhang,K.,Liu,J.,Xi,J.J.,Qiu,J.L.,andGao,C.(2013)TargetedgenomemodificationofcropplantsusingaCRI

4、SPR-Cassystem.Nat.Biotechnol.31:686-688.【水稻/小麥；非雙元載體(zit)】Li,J.F.,Norville,J.E.,Aach,J.,McCormack,M.,Zhang,D.,Bush,J.,Church,G.M.,andSheen,J.(2013)Multiplexandhomologousrecombination-mediatedgenomeeditinginArabidopsisandNicotianabenthamianausingguideRNAandCas9.Nat.Biotechnol.31:688-691.【擬南芥/煙草】Nekra

5、sov,V.,Staskawicz,B.,Weigel,D.,Jones,J.D.,andKamoun,S.(2013)TargetedmutagenesisinthemodelplantNicotianabenthamianausingCas9RNA-guidedendonuclease.Nat.Biotechnol.31:691-693.【煙草】【上述3篇文章同時(shí)發(fā)表】Feng,Z.,Zhang,B.,Ding,W.,Liu,X.,Yang,D.L.,Wei,P.,Cao,F.,Zhu,S.,Zhang,F.,Mao,Y.,andZhu,J.K.(2013)Efficientgenomee

6、ditinginplantsusingaCRISPR/Cassystem.CellRes.【擬南芥/水稻】共二十九頁 2013年植物(zhw)CRISPR/Cas研究論文Xie,K.andYang,Y.(2013)RNA-guidedGenomeEditinginPlantsUsingACRISPR-CasSystem.Mol.Plant.【水稻(shudo)】Mao,Y.,Zhang,H.,Xu,N.,Zhang,B.,Gao,F.,andZhu,J.K.(2013)ApplicationoftheCRISPR-CasSystemforEfficientGenomeEngineeringin

7、Plants.Mol.Plant.【擬南芥/水稻】Miao,J.,Guo,D.,Zhang,J.,Huang,Q.,Qin,G.,Zhang,X.,Wan,J.,Gu,H.,andQu,L.J.(2013).TargetedmutagenesisinriceusingCRISPR-Cassystem.CellRes.23:1233-1236.【水稻】Jiang,W.,Zhou,H.,Bi,H.,Fromm,M.,Yang,B.,andWeeks,D.P.(2013).DemonstrationofCRISPR/Cas9/sgRNA-mediatedtargetedgenemodificatio

8、ninArabidopsis,tobacco,sorghumandrice.NucleicAcidsRes.PMID:23999092.【擬南芥/煙草/高粱/水稻】共二十九頁/news/show/6268.html完美基因編輯：新方法可消除CRISPR-Cas的脫靶(tu b)效應(yīng)http:/news/show/6342.htmlCRISPR-Cas助力(zh l)大規(guī)?；蚪M研究高彩霞等首次將CRISPR-Cas用于植物基因組編輯/news/show/6624.htmlScience：革命性基因編輯技術(shù)CRISPR 狂潮來勢(shì)洶洶/news/show/6826.html基因組工程學(xué)里的三大利器

9、 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas/news/show/6897.htmlCell：張鋒揭示增加基因組編輯特異性的新方法http:/news/show/6944.htmlPNAS：清華大學(xué)開發(fā)基因組編輯新技術(shù)http:/news/show/7740.html/news/show/6236.html華人青年科學(xué)家張峰獲美國(guó)生物醫(yī)學(xué)大獎(jiǎng)國(guó)內(nèi)專業(yè)網(wǎng)站有關(guān)CRISPR/Cas技術(shù)的報(bào)道共二十九頁生物360（郵件列表）Science：革命性基因編輯技術(shù)(jsh)CRISPR 狂潮來勢(shì)洶洶/news/show/6826.html生物谷（郵件列表）革命性基因編輯(binj)技術(shù)CRISPR漸成科學(xué)家

10、新寵http:/trends/news/580602.shtml生命奧秘雜志（郵件列表）CRISPR熱潮http:/?p=32833國(guó)內(nèi)專業(yè)網(wǎng)站有關(guān)CRISPR/Cas技術(shù)的報(bào)道共二十九頁Nucl. Acids Res.-2013-DiCarlo-nar_gkt135原理(yunl)Cas9gRNAgDNA20 nt共二十九頁Elizabeth Pennisi.The CRISPR Craze. Science 23 August 2013; DOI:10.1126/science.341.6148.833基因組編輯(binj)（基于DSB）NHEJHDR基因(jyn)干擾基因激活原理設(shè)想一下

11、：一個(gè)人（Cas9）拿著一把鑰匙（gRNA）去開一棟大樓中的某個(gè)房間。共二十九頁CRISPR/Cas技術(shù)(jsh)在植物中應(yīng)用存在的問題在斑馬魚、大鼠和小鼠中，通過(tnggu)向單細(xì)胞時(shí)期胚胎同時(shí)注射體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和gRNA，可以獲得雙位點(diǎn)突變的純合突變體動(dòng)物。但在植物中不可行。在植物中需要獲得Cas9和gRNA的轉(zhuǎn)基因株系。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是植物轉(zhuǎn)基因的常規(guī)方法，但在已經(jīng)發(fā)表的8篇文章中，需要兩個(gè)克隆步驟才能完成農(nóng)桿菌雙元載體的構(gòu)建：第一步構(gòu)建gRNA表達(dá)框；第二步將gRNA表達(dá)框插入到雙元載體上。缺乏組裝3個(gè)以上gRNA表達(dá)框的方法；CRISPR/Cas工具不夠齊全，因而需

12、要進(jìn)一步完善以便用于基因表達(dá)調(diào)控等方面。共二十九頁235Sp-zCas9U6-26p-gRNAUbi1p-zCas9OsU3p-gRNACRISPR/Cas雙元載體(zit)結(jié)構(gòu)共二十九頁Vector nameCas9aPol III promoterapHSN/BUN4013FLAG-NLS-zCas9-NLS (4)AtU6-26 (01)pHSN/BUN4113FLAG-NLS-zCas9-NLS (4)OsU3p (11)pHSN/BUN501zCas9D10A (5)AtU6-26 (01)pHSN/BUN601dCas9 (6)AtU6-26 (01)pHSN/BUN6A01dCa

13、s9-VP64 (6A)AtU6-26 (01)pHSN/BUN6B01dCas9-VP16-ER (6B)AtU6-26 (01)pHSN/BUN6C01dCas9-VP64-ER (6C)AtU6-26 (01)pHSN/BUN6D01dCas9-VP64-ER2 (6D)AtU6-26 (01)pHSN/BUN6E01dCas9-VP16-GR (6E)AtU6-26 (01)pHSN/BUN6F01dCas9-KRAB (6F)AtU6-26 (01)表1 各種各樣( zhn yn)的CRISPR/Cas雙元載體共二十九頁構(gòu)建(u jin)含1個(gè)gRNA的CRISPR/Cas雙元載體共

14、二十九頁構(gòu)建(u jin)含2個(gè)gRNA的CRISPR/Cas雙元載體共二十九頁構(gòu)建(u jin)含4個(gè)gRNA的CRISPR/Cas雙元載體共二十九頁靶點(diǎn)選擇要點(diǎn)：N20NGG（正向或反向鏈）【必要】序列特異性檢查【必要】切割點(diǎn)應(yīng)位于外顯子【必要】切割點(diǎn)最好位于酶切位點(diǎn)中央【可選】靶點(diǎn)最好是GN19NGG【可選】單基因選雙靶點(diǎn)可提高(t go)突變效率【可選】我們(w men)構(gòu)建的CRISPR/Cas雙元載體使用極其簡(jiǎn)單，用戶只需要1對(duì)各23-nt的oligo插入gRNA前面即可！真正做到規(guī)模化和高通量！對(duì)于模式植物擬南芥等而言，研究人員自己創(chuàng)制靶基因突變體的時(shí)代已經(jīng)來臨！共二十九頁使用C

15、RISPR/Cas技術(shù)敲除玉米(ym)靶基因流程選擇靶點(diǎn)；構(gòu)建CRISPR/Cas雙元表達(dá)載體；在玉米原生質(zhì)體中驗(yàn)證靶點(diǎn)；轉(zhuǎn)化玉米幼胚；提取抗性愈傷基因組DNA；PCR或巢式PCR擴(kuò)增含靶點(diǎn)DNA片段，酶切鑒定PCR片段，測(cè)序PCR片段確認(rèn)突變類型；PCR及酶切鑒定再生植株，獲得雙位點(diǎn)突變體。若突變體為嵌合體，可以在下一代篩選分離(fnl)的突變體。鑒定T2代種子，得到純合突變體。共二十九頁CACCTGGTGCTGTTCCATGTGCACCCGTTCTGGATCCAAGTCCTGTACTTCCTTTTGATCTCCGTTTTGGGTTTCTTGATGCTGAGAGTCCTGCCCATGAAGT

16、CCAGCTCCGTGCCTAGGCCCTCGGCTCTGGACCTACTCTTCACGTCGGTGTCGGCGACGACAGTCTCCAGCATGATCGCCGTCGAGATGGAATCCTTCTCTAACGCGCAGCTCCTCCTCATGACCCTCCTTATGCTCCTCGGGGGCGAGGTGTTCACAAGCATGCTTGGTCTCCACTTCACCTGCACCAAGCTCAGAAACAAGAGAGAAACACCTCATAATAATCTCCATGGTAATAGCTTAGAGCAGAGTCGTCGTCGTCACCGTCCCATGGAGATGGAAGCCCAGGCCGCCGCCGTCC

17、AAATGGAGCTTGCAGGGTTCAACAAGGACGGCCATGGCGATTTCGCATCCATGGCTAGgttgctaatgtttatcgtgctgggctacatcttggtcgtgcacatcgccggctacgcgctcattctaatctaccttagCGTGGTCGGCAGCGCGAGAGCAGTGCTTGTTAGGAAGAGGATCAGCCTGAGCACCTTCTCCGTCTTCACGGTCGTCTCGTCGTTCGCAAACTGTGGCTTCGTGCCAACCAACGAGGGGATGGTGTCCTTCAAGTCCTTCCCGGGCATGCTCCTCCTGGTCATGC

18、CACACATCCTGCTCGGGAACACGCTCTTCCCCATCTTCCTCAGGCTCTCCATTACGGCGCTCGAGAGGGTCACAAGGTGGCGAGACCTCTGCGAGCTGCTGAGAGACAGAGGACCCGGCGGCGGGCCAGCTGCGGCTGCCGCCGCCGCCGCTATAGGCTACGACCACCTGCTCCCGGGACCGCGCACATGGTTCCTTGCTCTCACCGTGGCGGTGTTCCTGGCGGTGCAGCTGGTGCTCTACTGCGCCATGGAGTGGGGCTCCGGTGGCCTTGGAGGGCTCAACGCGTTCCAGAAGCTCG

19、TTGCAGCGGTCTTCATGTCCGTCAACTCCAGGCACTCCGGCGAGATGGTCGTCGACCTCGCCACCGTCTCCTCCGCCGTCGTCGTGCTGTATGTGCTCATGATgtaagtacatacctgcacacatccatcgatccatctatcagaagatcatcggtagtgttaatttggatcagatcagaagtttgtgcactacatttatcatatacttatatatgtcatgcatgcacacagaaactatcattagttttttttctttaaataattttactcggttgctcatatgcttatttctcctcttc

20、agGTATCTACCGCCTTACACTACATTTTTACCGGTAGCAGTGGAAGACGACCAGCAGCAGCAAAATGAGGCACAACCCCACGACAATAGCACGAGCAAGAGCAGCACAAGTATTAGCATCTGGCACAATCTGCTCATGTCGCCGCTCTCGTGCCTAACCATCTTCATCGTCGTCATCTGCATCACCGAGAGGCGGCAGATTGCTCGTGACCCAATCAACTTCAGCGTCCTCAACATCGTCGTCGAGGTCATCAGgtgtttatatatcactcctattatttaattaactgccggcgcgcgc

21、aatagatctctcgcattgcagtggactgcgccattgaagcaataatccaacgtgctgatatgcatgcagTGCGTATGGCAACGTGGGATTCAGCACCGGGTACAGCTGCAGCAGGCAGGTGACGCCCGGCGGCGGCTGCTGCAAGGACGCGTGGGTTAGCTTGTCCGGCAAGTGGAGTGTGGAAGGGAAGCTCACGCTCATGGCCATCATGTTCTATGGCAGGCTCAAGAAGTTCAGCATGCTTGGGGGTCAGGCATGGAGGCTGAACTGAACCGAAGTACTATTTCGAAACTCGCTCGA

22、TCAACCTGATCTCCAGGACTCCAAGACTAGTACTTGAATTCTCAGTCTATTCAGACGGAACCGGATCATATGACAAATCCATCTGCGAGGAGTTTGGCTGCATTCTGTAAAGTCGGTAGGGGCAAGGGGTTGTTCATATCCTTTTTATTTAAAAATAAAAAATAGTTTTATZmHKT1 genomic DNA (IDF0+IDR0=732bp/IDF+IDR=569bp)IDF0IDFIDR0IDRPAMXcmI20bp target20bp targetSphIPAM5-UTR3-UTRExon highlighted by

23、 yellow intron共二十九頁玉米(ym)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)CRISPR/Cas雙元載體轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體，提取基因組DNA；巢式PCR擴(kuò)增，酶切分析PCR產(chǎn)物；測(cè)序確認(rèn)靶位點(diǎn)突變(tbin)方式。ZmHKT1第1個(gè)靶點(diǎn)突變分析hCas9-1hCas9-2zCas9U6-26pOsU3p共二十九頁T7 E1 assay/Surveyor assayZmHKT1第1個(gè)靶點(diǎn)各種各樣( zhn yn)的突變ZmHKT1第2個(gè)靶點(diǎn)突變(tbin)分析共二十九頁使用(shyng)兩個(gè)gRNA同時(shí)敲除3個(gè)擬南芥靶基因：載體(zit)1：p2gR-TRI-1TRI-T1-1-gRNA + TRI-T2-

24、gRNA + zCas9載體2：p2gR-TRI-2TRI-T1-2-gRNA + TRI-T2-gRNA + zCas9共二十九頁測(cè)序分析轉(zhuǎn)基因株系3個(gè)靶位點(diǎn)突變(tbin)（體細(xì)胞突變(tbin)形成嵌合體）：共二十九頁P(yáng)lant CRISPR/Cas toolkit based on pCambia binary vectors (underway)235Sp-zCas9U6-26p-gRNApCambia1300 derived Hyg(R)235Sp-zCas9U6-26p-gRNApCambia3300 derived Bar235Sp-zCas9U6-26p-gRNApCambi

25、a2300 derived Kan(R)雙子葉轉(zhuǎn)化(zhunhu)Type IISAraIBbsI(BpiI)BsaI(Eco31I)BsmBI(Esp3I)BspMI(BveI)BtgZIBsaI是最便宜(biny)的Type IIS RE；BsaI價(jià)格是AarI的1/50。使用卵細(xì)胞特異表達(dá)啟動(dòng)子代替35Sp驅(qū)動(dòng)Cas9值得嘗試！共二十九頁Ubi1p-zCas9OsU3p-gRNApCambia1300 derived Hyg(R)pCambia3300 derived BarUbi1p-zCas9OsU3p-gRNA水稻(shudo)轉(zhuǎn)化玉米(ym)轉(zhuǎn)化單子葉轉(zhuǎn)化我們也在嘗試將CRISRP/Cas和lambda噬菌體RED重組系統(tǒng)整合起來實(shí)現(xiàn)玉米等作物的高效定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)。共二十九頁zCa9玉米(ym)（Ubi1p-zCa9轉(zhuǎn)基因B73玉米）dC