蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)精選

1、蛋白質(zhì)分子(fnz)設(shè)計(jì)共五十四頁分子(fnz)設(shè)計(jì)分子設(shè)計(jì)的提出的背景1927 年HeitlerLondon 用量子力學(xué)(lin z l xu)成功討論氫分子的結(jié)構(gòu),量子化學(xué)迅速發(fā)展。計(jì)算技術(shù)的革命和計(jì)算方法的改善,量子化學(xué)的應(yīng)用范圍越來越廣,其概念和計(jì)算方法逐漸應(yīng)用到了化學(xué)動(dòng)力學(xué)、催化、電化、生物、藥物等領(lǐng)域,產(chǎn)生了一個(gè)個(gè)新的學(xué)科分支微觀反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、量子催化、量子電化、量子生物和量子藥物等,和光譜學(xué)結(jié)合,更促使化學(xué)及其相鄰學(xué)科朝著推理化、定理化、微觀化的方向發(fā)展。2共五十四頁分子設(shè)計(jì)(shj)的定義20 世紀(jì)70 年代,美國(guó)麻省理工學(xué)院霍恩貝爾教授提出了分子設(shè)計(jì)。即從分子、電子水平上,通過

2、數(shù)據(jù)庫等大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)合現(xiàn)代量子化學(xué)(lin z hu xu)方法,通過計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)等設(shè)計(jì)新的分子。設(shè)計(jì)的新分子或具有某種特定性能,可以是藥物、材料或其他,或是一種概念、一種復(fù)合物或具有分子意義的物質(zhì)(如催化劑等) 。3共五十四頁蛋白質(zhì)的分子(fnz)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)是一門新興的研究領(lǐng)域，其本身在不斷(bdun)地發(fā)展，其內(nèi)容也在不斷(bdun)地更新。蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)就是為有目的的蛋白質(zhì)工程改造提供設(shè)計(jì)方案。蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的目的：蛋白質(zhì)工程提供指導(dǎo)信息探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理。 4共五十四頁蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目前存在的問題1、與天然的蛋白質(zhì)比較(bjio)，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明 顯的功能優(yōu)越性2

3、、三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差共五十四頁第一節(jié) 基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jigu)的設(shè)計(jì)一、概述(i sh) 計(jì)算機(jī)模擬 基因構(gòu)建突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品功能分析蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)共五十四頁蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)涉及多種學(xué)科的配合，如計(jì)算機(jī)模擬專家、X射線晶體學(xué)家、蛋白質(zhì)化學(xué)家、生物技術(shù)專家等的合作和配合專一性突變產(chǎn)物是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成敗的關(guān)鍵。一些新技術(shù)，如PCR及自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展使各種類型的基因工程變得快速、容易。計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)中占有重要位置，建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，確立突變位點(diǎn)或區(qū)域以及預(yù)測(cè)(yc)突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)果和功能對(duì)蛋白質(zhì)工程是至關(guān)重要的。在明確突變位點(diǎn)或蛋白質(zhì)序列應(yīng)改變的區(qū)域后，可以進(jìn)行定位突變，但要

4、得到具有預(yù)期結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)是不容易的，可能需要經(jīng)過幾輪的循環(huán)共五十四頁蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)(jigu)知識(shí)的必要性8蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)知識(shí)對(duì)于蛋白質(zhì)工程是絕對(duì)必要的。目前PDB(Protein Data Bank)已收集數(shù)以萬計(jì)個(gè)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，但是通常蛋白質(zhì)序列的數(shù)目比蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的數(shù)目大100倍。當(dāng)我們開始對(duì)某一天然蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)時(shí)：首先要查找PDB了解這個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是否已被收錄。如果PDB中沒有(mi yu)收錄又未見文獻(xiàn)報(bào)道，我們需要通過蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)及NMR方法測(cè)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，或者通過結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法構(gòu)建該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。共五十四頁蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)(shj)的流

5、程天然(tinrn)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)晶體學(xué)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)幾何優(yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果分析與原先的結(jié)構(gòu)比較蛋白質(zhì)合成定位突變分離、純化及表征新蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的輸入共五十四頁P(yáng)r突變體設(shè)計(jì)(shj)的3個(gè)步驟從天然蛋白質(zhì)的三位結(jié)構(gòu)出發(fā)（實(shí)驗(yàn)測(cè)定或預(yù)測(cè)），利用計(jì)算機(jī)技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換的氨基酸利用能量?jī)?yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)-功能或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算預(yù)測(cè)新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)共五十四頁二、 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)(shj)原理內(nèi)核假設(shè)。蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互

6、作用決定。（內(nèi)部十分保守的區(qū)域）Pr內(nèi)部都是密堆積（很少有空穴大到水分子可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰性氣體），沒有重疊所有(suyu)內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側(cè)鏈）。蛋白質(zhì)的氫鍵形成涉及一個(gè)交換反應(yīng)，溶劑鍵被蛋白質(zhì)鍵所取代疏水及親水基團(tuán)需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面。分布代表疏水效應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力共五十四頁 蛋白質(zhì)分子(fnz)設(shè)計(jì)原理金屬Pr中配位殘基的替換要滿足(mnz)金屬配位幾何。要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質(zhì)側(cè)鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長(zhǎng)、鍵角以及整體的幾何。對(duì)于金屬Pr，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質(zhì)主鏈的相互作用。最優(yōu)

7、的aa側(cè)鏈幾何排列。Pr側(cè)鏈構(gòu)象由空間兩個(gè)立體因素所決定(一是立體勢(shì)壘，二是aa的位置)結(jié)構(gòu)及功能的專一性。這是Pr設(shè)計(jì)最困難的問題共五十四頁蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)(shj)的分類蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)又可按照改造部位的多寡分為三類(sn li)：第一類為“小改”，可通過定位突變或化學(xué)修飾來實(shí)現(xiàn)；第二類為“中改”，對(duì)來源于不同蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝；第三類為“大改”，即完全從頭設(shè)計(jì)全新的蛋白質(zhì)（de novo protein design）。13共五十四頁小改少數(shù)(shosh)殘基的替換定義： 小改是指對(duì)已知結(jié)構(gòu)(jigu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個(gè)殘基的替換，這是目前蛋白質(zhì)工程中最為廣泛使用的方法。采用的方法：

8、 主要通過定點(diǎn)突變技術(shù)或盒式替換技術(shù)有目的改變幾個(gè)氨基酸殘基，借以研究和改善蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能。 14共五十四頁小改兩個(gè)(lin )層次1已知立體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上所進(jìn)行的工作，直接將立體結(jié)構(gòu)信息(xnx)與蛋白質(zhì)的功能相關(guān)聯(lián)的高層次的設(shè)計(jì)2借助蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)，在未知立體結(jié)構(gòu)的情形下所進(jìn)行的分子設(shè)計(jì)工作本部分只介紹第一種，實(shí)際上第一種已經(jīng)包含第二種，第二種只是在不得已的情況下采取的一種努力。15共五十四頁一、定位(dngwi)突變 基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子“小改”是指對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個(gè)殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前(mqin)蛋白質(zhì)工程中最廣泛使用的方法，

9、主要可分為蛋白質(zhì)修飾和基因定位突變兩類。 共五十四頁（一）定位突變的設(shè)計(jì)目標(biāo)(mbio)及解決方法 定位突變常見的設(shè)計(jì)(shj)目標(biāo)是提高蛋白質(zhì)的熱、酸穩(wěn)定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究等。 共五十四頁Hartley等于1986年完成了一個(gè)設(shè)計(jì)(shj)目標(biāo)及解決的辦法 ：熱穩(wěn)定性對(duì)氧化的穩(wěn)定性對(duì)重金屬的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性提高(t go)酶學(xué)性質(zhì)引入二硫橋，增加內(nèi)氫鍵數(shù)目，改善內(nèi)疏水堆積把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr替代表面羧基，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu替換表面荷電基團(tuán)，His、Cys以及Tyr

10、的置換專一性的改變，增加逆轉(zhuǎn)數(shù)， 改變酸堿度 共五十四頁（二）定位(dngwi)突變的種類 要進(jìn)行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學(xué)合成、基因直接修飾法、盒式突變技術(shù)等。 根據(jù)基因突變的方式，分為以下三類： 插入一個(gè)或多個(gè)(du )氨基酸殘基； 刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基； 替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。 要達(dá)到基因定位突變的目的，多采用體外重組DNA技術(shù)或PCR方法。共五十四頁蛋白質(zhì)中功能(gngnng)殘基的鑒定根據(jù)結(jié)構(gòu)(jigu)信息確定殘基的突變突變方法鑒定突變功能殘基利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基三、蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定共五十四頁1根據(jù)(gnj)結(jié)構(gòu)信息確

11、定殘基的突變最有效最直接(zhji)的方法 Alan Fersht和GregWinter等測(cè)定了酪氨酰-tRNA合成酶突變體的三維結(jié)構(gòu)，通過分析該酶的Cys35被結(jié)構(gòu)相似的絲氨酸所取代后的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Cys35可能與酪氨酰腺苷酸中間體中的3羥基形成氫鍵，突變效應(yīng)降低了酶的活性，證實(shí)了Cys35在結(jié)合腺苷酸部分的作用。 共五十四頁例一：核糖核酸(h tn h sun)酶 小改舉例結(jié)構(gòu)知識(shí)：核糖核酸酶含有104個(gè)氨基酸殘基，該天然酶具有兩對(duì)二硫鍵（Cys2-Cys10，Cys6-Cys103）。小改設(shè)計(jì)：在不失去酶活性的基礎(chǔ)(jch)上增加它的穩(wěn)定性，日本大阪大學(xué)蛋白質(zhì)工程研究所的Satoshi N

12、ishikawa等人嘗試在Tyr（酪氨酸）24和Asn（天冬酰氨）84位引入第三個(gè)二硫鍵。22共五十四頁分子設(shè)計(jì)和理論驗(yàn)證：從該酶晶體結(jié)構(gòu)可以看出這兩個(gè)殘基是遠(yuǎn)離催化位點(diǎn)的，經(jīng)過分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算證明在這兩個(gè)殘基之間有可能形成二硫鍵，并且不會(huì)影響催化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。并且采用分子力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)方法從核糖核酸的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)建立起核糖核酸突變體的模型。將Tyr24和Asn84兩個(gè)殘基側(cè)鏈（保留C，C）消除，將C轉(zhuǎn)變?yōu)镾。P3然后經(jīng)過1000輪突變部位能量最小化和2000輪整體能量最小化以及分子動(dòng)力學(xué)模型建立突變體的結(jié)構(gòu)模型，結(jié)構(gòu)模型中沒有不合理的鍵長(zhǎng)、鍵角和二面角。從設(shè)計(jì)的角度看這個(gè)突變是合理的。方案的

13、實(shí)施：通過基因(jyn)技術(shù)得到突變體，實(shí)驗(yàn)證明突變體在保持天然酶活性的基礎(chǔ)上大幅度提高了酶的熱穩(wěn)定性。 23共五十四頁例二、酪氨酰-tRNA合成酶的分析(fnx)在酪氨酰-tRNA合成酶中Cys35被結(jié)構(gòu)(jigu)相似的氨基酸Serine(19)所取代。在這個(gè)酶的低分辨率的晶體結(jié)構(gòu)（0.3nm）中看出，Cys35在結(jié)合腺苷酸中間體中的3羥基形成氫鍵，見圖。突變效應(yīng)降低了酶的活性，證實(shí)了Cys35在結(jié)合腺苷酸部分的作用。以后的高分辨率的酶結(jié)合酪氨酸腺苷酸的晶體結(jié)構(gòu)表明在酶與底物之間可能存在11條氫鍵，每個(gè)氫鍵基團(tuán)都經(jīng)過突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)每個(gè)基團(tuán)對(duì)于催化功能的貢獻(xiàn)。共五十四頁共五十四頁2其他實(shí)驗(yàn)方法

14、鑒定(jindng)突變功能殘基隨機(jī)突變刪除分析(fnx)連接片段掃描突變 共五十四頁例1：HIV-1蛋白酶蛋白酶的99個(gè)殘基的編碼區(qū)的每個(gè)殘基用不同的氨基酸替換，得到33個(gè)突變體，平均每個(gè)殘基有3.3個(gè)替代物。在82位置非保守殘基的替換會(huì)引起誤導(dǎo)。纈氨酸在這個(gè)(zh ge)位置視疏水殘基（Ile,Leu,Phe）或小的中性殘基（Ala,Thr）的取代對(duì)蛋白質(zhì)的功能沒有產(chǎn)生有害影響。而非保守殘基（Asp或Gly）的置換是沒有可容忍性。實(shí)驗(yàn)證明三個(gè)區(qū)域?qū)ν蛔兪庆`敏的，而且推測(cè)其有功能重要性。基于位置9的脯氨酸用Thr、His及Arg替代沒有可容忍性，說明它是重要的。用Ser(典型的保守殘基)替代

15、對(duì)活性沒有影響，說明這個(gè)位置是結(jié)構(gòu)靈敏而不涉及蛋白酶的活性共五十四頁例2：掃描(somio)刪除分析對(duì)鼠和人GM-CSF重要活性區(qū)域的鑒定GM-CSF（粒狀白細(xì)胞大噬菌體激活因子）的功能是刺激血細(xì)胞的增殖。通過突變?cè)?個(gè)氨基酸的間隔(jin g)里刪除3個(gè)氨基酸。通過蛋白質(zhì)的E.coli大腸桿菌中表達(dá)以及檢測(cè)它們刺激骨髓細(xì)胞線的增殖能力，與天然的GM-CSF比較，大多數(shù)的刪除使活性完全喪失，只有很少幾個(gè)刪除保持中等的活性。鑒定出刪除后完全失活的五個(gè)區(qū)域，其中兩個(gè)是有專一性的，它們對(duì)受體結(jié)合活性有重要影響。共五十四頁3利用(lyng)蛋白質(zhì)同源性鑒定突變功能殘基高度保守的殘基與同源蛋白的共同功能

16、以及維持(wich)結(jié)構(gòu)有關(guān) 。非保守殘基是分析的靶位點(diǎn)，特別是對(duì)于專一性研究。探測(cè)突變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)整體性質(zhì)，以鑒定突變殘基。 共五十四頁四、天然(tinrn)蛋白質(zhì)的剪裁共五十四頁第二節(jié) 全新(qun xn)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)共五十四頁一、引言(ynyn)共五十四頁二、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(jigu)的從頭設(shè)計(jì)共五十四頁1.二級(jí)結(jié)構(gòu)(jigu)模塊單元的自組裝共五十四頁2.配體誘導(dǎo)(yudo)組裝共五十四頁3.通過共價(jià)交叉連接(linji)實(shí)現(xiàn)肽的自組裝共五十四頁4.在合成(hchng)模板上肽的組裝共五十四頁5.線性多肽(du ti)折疊為球狀結(jié)構(gòu)共五十四頁6.基于(jy)組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)共五十四頁三

17、、蛋白質(zhì)的功能設(shè)計(jì)共五十四頁1.通過反向擬合天然(tinrn)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)新的功能共五十四頁2.鍵合及催化的從頭(cngtu)設(shè)計(jì)共五十四頁3.在全新(qun xn)蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點(diǎn)共五十四頁4.催化活性蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)(shj)共五十四頁5.膜蛋白及離子通道的設(shè)計(jì)(shj)共五十四頁6.新材料(cilio)的設(shè)計(jì)共五十四頁第三節(jié)、計(jì)算(j sun)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)共五十四頁一、能量(nngling)表達(dá)共五十四頁二、能量(nngling)優(yōu)化共五十四頁三、序列(xli)優(yōu)化共五十四頁四、序列(xli)-結(jié)構(gòu)專一性共五十四頁五、底物(d w)專一性設(shè)計(jì)共五十四頁六、金屬結(jié)合(jih)位點(diǎn)的設(shè)計(jì)共五十四頁內(nèi)容摘要蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)。分子設(shè)計(jì)的提出的背景。預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)-功能或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān)