小量全血基因組DNA快速提取(離心柱型)操作方法及步驟說明書

1、杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp:/ TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號(hào) RP02 使用手冊(cè) 實(shí)驗(yàn)室使用，僅用于體外 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號(hào) RP02 使用手冊(cè) 實(shí)驗(yàn)室使用，僅用于體外 TRIpure Reagent 抽提指南 目錄號(hào) RP02 使用手冊(cè) 實(shí)驗(yàn)室使用，僅用于體外小量全血基因組DNA快速提取試劑盒目錄號(hào)：DN01目錄編號(hào)包裝單位DN010150次DN0102100次DN0103200次DN011150次(帶蛋白酶K粉)DN0112100次(帶蛋白酶K粉)DN0113200次(帶蛋白酶K粉)v 適用范圍：適用于快速提取全血基因組DNA

2、v 試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：試劑盒組成保存50次100次200次平衡液室溫5 ml 10 ml20 ml緩沖液BB室溫10 ml20 ml40 ml結(jié)合液CB室溫15 ml30 ml60 ml抑制物去除液IR室溫25 ml50 ml100 ml漂洗液WB室溫15 ml 25 ml 50 ml第一次使用前按說明加指定量乙醇洗脫緩沖液EB室溫15 ml15 ml15 ml x 2 蛋白酶K粉（可選）20mg/ml-2020mg20mg×220mg×4吸附柱AC室溫50個(gè)100個(gè)200個(gè)收集管（2ml）室溫50個(gè)100個(gè)200個(gè)本試劑盒在室溫儲(chǔ)存12個(gè)月不影響使用效果。儲(chǔ)存事項(xiàng)

3、:1. 結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。2. 為避免降低活性，方便常溫運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解。因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存，20保存。3. 避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中發(fā)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。v 產(chǎn)品介紹：獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗離心的步驟， 抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝

4、物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。v 產(chǎn)品特點(diǎn)：1. 不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。2. 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作一般可在20分鐘內(nèi)完成。3. 多次柱漂洗確保高純度，典型的產(chǎn)量200µl全血可提取出3-12µg，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.71.9，長度可達(dá)30 kb -50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。4. 從十幾個(gè)配方中優(yōu)選出的紅細(xì)胞裂解液配方，裂解快速完全，客戶可根據(jù)需要選擇購買。5. 典型的產(chǎn)量200µl全血可提取出3-12µg 基因組D

5、NA。v 注意事項(xiàng)：1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。2. 不同樣品尤其疾病樣品中白細(xì)胞數(shù)量差異可能非常大，因此產(chǎn)量的個(gè)體差異也可能非常大。3. 需要自備異丙醇。4. 開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到70備用。5. 為了最佳效果，最好使用新鮮血液標(biāo)本或者4存放少于3天的標(biāo)本，不要使用反復(fù)凍融超過3次的標(biāo)本，否則會(huì)嚴(yán)重降低產(chǎn)量。6. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在20。DN

6、A如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。v 關(guān)于平衡液的使用1. 介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會(huì)同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預(yù)處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團(tuán)，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是強(qiáng)堿性溶液，若不小心碰到，請(qǐng)用大量自來水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過程中可能有沉淀生成，請(qǐng)加熱至37使沉淀完全消失。2. 使用方法：取一個(gè)新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100

7、l的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時(shí)平衡液預(yù)處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。v 操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!1. 取200ul新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，放入1.5ml離心管。如果全血起始量小于200l，則用緩沖液BB補(bǔ)足到200l。如果起始量介于200l-300l之間，則后續(xù)操作需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介于300l-1ml之間，則需要先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解操作（見本說明書后附錄）。如果處理血樣為

8、禽類、鳥類、兩棲類或更低級(jí)生物的抗凝血液，其紅細(xì)胞為有核細(xì)胞，因此處理量5-20l，可加緩沖液BB補(bǔ)足到200l后進(jìn)行后續(xù)步驟。2. 加入20l蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200l結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70放置10分鐘。溶液應(yīng)變清亮（但顏色偏黑色）。 可選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200l 結(jié)合液CB 前加20l RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。平衡液預(yù)處理吸附柱備用：使用平衡液預(yù)處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見前文“關(guān)于平衡液的使用”3. 冷卻后加入100l 異丙醇，立刻

9、渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可以渦旋振蕩15秒混勻。4. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。5. 加入500l抑制物去除液IR，12,000 rpm 離心30秒，棄廢液。 6. 加入600l漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。7. 加入600l漂洗液WB，12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。8. 將吸附柱AC放回空收集管中，13

10、,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。9. 取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100l洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70水浴中預(yù)熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000 rpm離心1分鐘。洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于50l，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。10. DNA可以存放在2-8，如果要長時(shí)間存放，可以放置在20。v 附錄（以300l，1ml

11、全血舉例紅細(xì)胞裂解操作）：1. 吸取900l紅細(xì)胞裂解液到一個(gè)1.5ml離心管或者3ml紅細(xì)胞裂解液到一個(gè)15ml離心管。（紅細(xì)胞裂解液可向本公司購買）2. 將抗凝全血（使用前回復(fù)到室溫）顛倒混勻后，吸取300l全血和1ml全血分別加到上述1.5ml和15ml離心管中，顛倒6-8次，并倒置輕彈管壁，確保充分混勻。3. 室溫放置10分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次，幫助裂解紅細(xì)胞）。4. 12,000 rpm離心20秒（對(duì)于1.5ml離心管）或2,000-3,000 rpm離心5分鐘（對(duì)于15ml離心管），倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)），留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)

12、和大約10l的殘留上清。離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細(xì)胞團(tuán)，也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán)，說明紅細(xì)胞裂解很不充分，應(yīng)該再加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟3，4。5. 加入200l緩沖液BB渦旋振蕩重懸白細(xì)胞團(tuán)，充分分散白細(xì)胞團(tuán)。其中由于肝素抗凝血的白細(xì)胞沉淀團(tuán)很難打散重懸，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)裂解效果，建議選用非肝素的抗凝劑收集血液標(biāo)本。6. 現(xiàn)在可以按照操作步驟提取全血基因組DNA了。v 問題與解決方法問題評(píng)論與建議標(biāo)本中含有血凝塊*不恰當(dāng)?shù)拇娣艠?biāo)本，未充分混勻，未使用合適的抗凝劑-建議：丟棄有血凝塊的標(biāo)本，重新用EDTA，肝素，檸檬酸劑收集血液。紅

13、細(xì)胞裂解不完全*血液標(biāo)本裂解前沒有回復(fù)到室溫-建議：處理前先把血液標(biāo)本回復(fù)到室溫。*裂解時(shí)間不夠-建議：可延長裂解時(shí)間至15分鐘以上。*裂解過程中沒有混勻-建議：裂解過程中可以更多次顛倒混勻，或者輕彈管壁幫助裂解。DNA產(chǎn)量低*血液標(biāo)本中本身含有的白細(xì)胞數(shù)量低-建議：增加起始血液處理量。*血液標(biāo)本存放時(shí)間太長-建議：存放在4的血液標(biāo)本超過5天的產(chǎn)量可能大大降低，因此不要存放太久。*蛋白酶K失效了-建議：收到蛋白酶K后，按照每次使用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融。*裂解不完全或者和異丙醇沒有充分混勻-建議：加入結(jié)合液后，和加入蛋白酶K后立即吹打或者渦旋混勻；加入異丙醇后立即吹打或者渦旋混勻才加入吸附柱，如果太粘稠必須渦旋振蕩15秒充分混勻。*洗脫效率不高-建議：確保做了步驟8，否則殘留乙醇會(huì)影響洗脫效率，仔細(xì)閱讀仔細(xì)閱讀注意事項(xiàng)6和步驟9和只使用洗脫緩沖液EB洗脫。問題評(píng)論與建議DNA下游酶切不能切開或者酶切不完全*忘記做步驟8，乙醇抑制了酶切反應(yīng)-建議：做步驟8，然后空氣中晾幾分鐘，讓殘留乙醇揮發(fā)。*一些硅基質(zhì)膜成分一起洗脫下來，抑制了酶切反應(yīng)-建議：將洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鐘，小心取上清使用。 DNA長度小于15kb*血液樣品太老或者不正確的存放，造成DNA降解-建議：選用新鮮的血液樣品*操作不當(dāng)，造成對(duì)