凱氏定氮法原理資料

1、凱氏定氮法原理，方法步驟和計算方法（三少整理版）2008年09月25日星期四19:52三鹿奶粉事件讓全國人民知道了三聚家胺，食品中蛋白質(zhì)含量的現(xiàn)行國家標準和國際通行測定方法是經(jīng)典凱氏定氮法，三少作為一名分析人員，現(xiàn)在將凱氏定氮法原理，方法步驟和計算方法寫出來，看看凱氏定氮法在蛋白質(zhì)含量中的缺陷。何為凱氏定氮法？簡單地說，凱氏定氮法是一種檢測物質(zhì)中“氮的含量”的方法。蛋白質(zhì)是一種含氮的有機化合物，食品中的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸和催化劑分解后，產(chǎn)生的氨能夠與硫酸結(jié)合，生成硫酸氨，再經(jīng)過堿化蒸儲后，氨即成為游離狀態(tài)，游離氨經(jīng)硼酸吸引，再以硫酸或鹽酸的標準溶液進行滴定，根據(jù)酸的消耗量再乘以換算系數(shù)，就可以推算出

2、食品中的蛋白含量。一凱氏定氮法原理凱氏定氮法首先將含氮有機物與濃硫酸共熱，經(jīng)一系列的分解、碳化和氧化還原反應(yīng)等復(fù)雜過程，最后有機氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機氮硫酸鏤，這一過程稱為有機物的消化。為了加速和完全有機物質(zhì)的分解，縮短消化時間，在消化時通常加入硫酸鉀、硫酸銅、氧化汞、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點而加快有機物分解，除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類類提高沸點，但效果不如硫酸鉀。硫酸銅起催化劑的作用。凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多，除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、鋁酸鈉等，但考慮到效果、價格及環(huán)境污染等多種因素，應(yīng)用最廣泛的是硫酸銅。使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧

3、化劑以加速有機物氧化。消化完成后，將消化液轉(zhuǎn)入凱氏定氮儀反應(yīng)室，加入過量的濃氫氧化鈉，將NH4+專變成NH3通過蒸儲把NH3驅(qū)入過量的硼酸溶液接受瓶內(nèi)，硼酸接受氨后,形成四硼酸鏤，然后用標準鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。滴定消耗的標準鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù)，通過計算即可得出總氮量。在滴定過程中，滴定終點采用甲基紅-次甲基藍混合指示劑顏色變化來判定。測定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機氮和無機氮。反應(yīng)式如下：1.有機物中的氮在強熱和CuSO4濃H2SO4作用下，消化生成（NH42SO4反應(yīng)式為：H2SO4=SO2+H2O+OR.CH.COOH+O=R.CO.COOH+N

4、H3NH3R.CO.COOH+O=nCO2+mH2O2NH3+H2SO4=（NH4）2SO42 .在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸儲釋放出NH3,收集于H3BO3溶液中反應(yīng)式為：2NH4+OH-=NH3+H2ONH3+H3BO3=NH4+H2BO3-3 .再用已知濃度的HCI標準溶液滴定，根據(jù)HCI消耗的量計算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量。反應(yīng)式為：H2BO3-+H+=H3BO3蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的含氮化合物，每種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量約在14%18%,平均為16%（質(zhì)量分數(shù)）。凱氏定氮法測定出的含氮量，再乘以系數(shù)6.25,即為蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮裝置圖1.安全管2.導(dǎo)管

5、3.汽水分離管4.樣品入口5.塞子6.冷凝管7.吸收瓶8.隔熱液套9.反應(yīng)管10.蒸汽發(fā)生瓶本文為三少綜合整理所得，轉(zhuǎn)載請注明源自二方法和步驟（一）消化1、準備6個凱氏燒瓶，標號。1、2、3號燒瓶中分別加入適當濃度的蛋白溶液1.0mL,樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g,濃硫酸2.0mL,30%±氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對樣品測定進行校正。4、5、6號燒瓶中加入蒸儲水1.0mL代替樣液，其余所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置。先用微

6、火加熱煮沸，此時燒瓶內(nèi)物質(zhì)炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫，務(wù)必注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力，保持瓶內(nèi)液體微沸，至溶液澄清后，再繼續(xù)加熱使消化液微沸15min。在消化過程中要隨時轉(zhuǎn)動燒瓶，以使內(nèi)壁粘著物質(zhì)均能流入底部，以保證樣品完全消化。消化時放出的氣體內(nèi)含SO2具有強烈刺激性，因此自始自終應(yīng)打開抽水泵將氣體抽入自來水排出。整個消化過程均應(yīng)在通風櫥中進行。消化完全后，關(guān)閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。（二）蒸儲和吸收蒸儲和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)進行的。凱氏定氮蒸儲裝置種類甚多，大體上都由蒸氣發(fā)生、氨的蒸儲和氨的吸收三部分組成。1、儀器的洗滌儀器安裝前，各部件需經(jīng)一般方法洗滌干凈，所

7、用橡皮管、塞須浸在10%NaO甯液中，煮約10min,水洗、水煮10min,再水洗數(shù)次，然后安裝并固定在一只鐵架臺上。儀器使用前，微量全部管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌，以除去管道內(nèi)可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可。較長時間未使用的儀器，重復(fù)蒸氣洗滌，不得少于三次，并檢查儀器是否正常。仔細檢查各個連接處，保證不漏氣。首先在蒸氣發(fā)生器中加約2/3體積蒸儲水，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結(jié)果，并放入少許沸石（或毛細管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸儲水約20mL讓水經(jīng)插管流入反應(yīng)室，但玻杯內(nèi)的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發(fā)生后，立即

8、關(guān)閉廢液排放管上的開關(guān)，使蒸氣只能進入反應(yīng)室，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過定氮球進入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水。從定氮球發(fā)燙開始計時，連續(xù)蒸煮5min,然后移開煤氣燈。沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動抽到反應(yīng)室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗23次，再在冷凝管下?lián)Q放一個盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中，蒸儲12min,觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色。如不變色，表示蒸儲裝置內(nèi)部已洗干凈。移去錐形瓶，再蒸儲1人2min,用蒸儲水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈，儀器即可

9、供測樣品使用。2、無機氮標準樣品的蒸儲吸收由于定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸儲和滴定的操作技術(shù)，初學者宜先用無機氮標準樣品進行反復(fù)練習，再進行有機氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的標準硫酸鏤測試三次。取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%月酸?容液20mL次甲基藍-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）34滴，蓋好瓶口待用。取其中一只錐形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸沒在溶液中。注意：在此操作之前必須先打開收集器活塞，以免錐形瓶內(nèi)液體倒吸。準確吸取2mL硫酸鏤標準液加到玻杯中，小心提起棒狀玻塞使硫酸鏤溶液慢慢流入蒸儲瓶中，用少量蒸儲水沖洗小玻杯3次，一并放人蒸儲瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10mL

10、30%NaO皤液，使堿液慢慢流入蒸儲瓶中，在堿液尚未完全流入時，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸儲水，再慢慢打開玻塞，使一半水流入蒸儲瓶，一半留在小玻杯中作水封。關(guān)閉收集器活塞，加熱蒸氣發(fā)生器，進行蒸儲。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時起，再蒸儲35min,移動錐形瓶使瓶內(nèi)液面離開冷凝管下口約lcm,并用少量蒸儲水沖洗冷凝管下口，再繼續(xù)蒸儲1min,移開錐形瓶，蓋好，準備滴定。在一次蒸儲完畢后，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器間的橡膠管，排除反應(yīng)完畢的廢液，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除。如此反復(fù)沖洗干凈后，即可進行下一個樣品的蒸儲。按以上方法用標

11、準硫酸鏤再做兩次。另取2mL蒸儲水代替標準硫酸鏤進行空白測定二次。將各次蒸儲的錐形瓶一起滴定。3、未知樣品及空白的蒸儲吸收將消化好的蛋白樣品三支，空白對照液三支，依次作蒸儲吸收。加5mL熱的蒸儲水至消化好的樣品或空白對照液中，通過小玻杯加到反應(yīng)室中，再用熱蒸儲水洗滌小玻杯3次，每次用水量約3mL洗滌液一并倒入反應(yīng)室內(nèi)。其余操作按標準硫酸鏤的蒸儲進行。由于消化液內(nèi)硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶內(nèi)倒出，必須加入熱蒸儲水5mL稀釋之，如果有結(jié)晶析出，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其流入反應(yīng)室。此外，還應(yīng)當注意趁儀器洗滌尚未完全冷卻時立即加入樣品或空白對照液，否則消化液通過冷卻的管道容易析出結(jié)

12、晶，造成堵塞。（三）滴定樣品和空白蒸儲完畢后，一起進行滴定。打開接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標準鹽酸溶液進行滴定。待滴至瓶內(nèi)溶液呈暗灰色時，用蒸儲水將錐形瓶內(nèi)壁四周淋洗一次。若振搖后復(fù)現(xiàn)綠色，應(yīng)再小心滴入標準鹽酸溶液半滴，振搖觀察瓶內(nèi)溶液顏色變化，暗灰色在一二分鐘內(nèi)不變，當視為到達滴定終點。若呈粉紅色，表明已超越滴定終點，可在已滴定耗用的標準鹽酸溶液用量中減去0.02mL,每組樣品的定氮終點顏色必須完全一致。空白對照液接受瓶內(nèi)的溶液顏色不變或略有變化尚未出現(xiàn)綠色，可以不滴定。記錄每次滴定耗用標準鹽酸溶液毫升數(shù)，供計算用。三結(jié)果與計算運算下列公式計算出每次無機氮標準樣品和

13、未知樣品的總含氮量。式中WN-每毫升樣品的含氮毫克數(shù)；A滴定樣品消耗的鹽酸量（mD;B滴定空白消耗的鹽酸量（mD;C測定樣品所取用量（mD;0.0100標準鹽酸物質(zhì)的量濃度（mol/L）;14.008每摩爾氮原子質(zhì)量（g/mol）。三次樣品測定的含氮量相對誤差應(yīng)小于土2%樣品粗蛋白含量=總氮量X6.256.25為含氮量換算為蛋白質(zhì)含量的系數(shù)。.這個系數(shù)來自蛋白質(zhì)平均含氮量為16%,實際上各種蛋白質(zhì)因氨基酸組成不同，含氮量不完全相同。孚L類為6.38,大米為5.95,花生為5.46等本文為三少綜合整理所得，轉(zhuǎn)載請注明源自凱氏定氮法的缺陷：從凱氏定氮原理可以知道：凱氏定氮法是將含氮有機物轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機氮硫酸鏤來進行檢測，以得到含氮量的測定值乘以一定系數(shù)得出蛋白質(zhì)含量。而含氮有機物不僅僅是蛋白質(zhì)，還有三聚家胺等等。在加上食品中蛋白質(zhì)含量的現(xiàn)行國家