鮑曼不動桿菌疫苗的研究進展.docx

1、.綜述.鮑曼不動桿菌疫苗的研究進展郭三君綜述,謝勇恩審校川北醫(yī)學(xué)院免疫與分子生物學(xué)研究室，四川南充637007摘要:鮑曼不動桿菌為不動桿菌屬中最常見的一種革蘭陰性桿菌，同時也是醫(yī)院獲得性感染的主要致病菌之一。由于其廣泛的耐藥性，普通抗生素對其治療效果已不明顯。近年來，國內(nèi)外學(xué)者嘗試通過研制抗菌疫苗的尹段來防治鮑曼不動桿菌感染，主要有滅活全菌體疫苗、外膜囊泡、重組蛋白亞單位疫苗、英膜多糖候選疫苗、聯(lián)合疫苗等?，F(xiàn)就鮑曼不動桿菌疫苗的研究進展進行了綜述。關(guān)鍵詞:鮑曼不動桿菌;滅活全菌體疫苗;外膜囊泡;重組蛋向亞單位疫苗;英膜多糖候選疫苗;聯(lián)合疫苗中圖分類號：R378.99文獻標(biāo)志碼：A文童編號：10

2、05-5673(2017)06-0075-05DOI：10.13309/ki.pmi.2017.06.013ProgressinAcinetobacterbaumanniivaccineGUOSan-jun,XIKYong-enResearchLaboratoryofImmunologyandMolecularBiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637007,SichuanProvince,ChinaCorrespondingauthor:XieYong-en,E-mail:cbyxyeO369Abstract:Acinetobacterbai

3、unannii(AB)isoneofthemostcommongram-negativebacteriainacinetobacterandoneoftheopportunisticpathogenscausedhospitalinfection.Becauseofitswiderangeofdrugresistance,lhetreatmentefficacyisnotsoefficientbycommonlyusedbroad-spectrumantibiotics.Manyresearcherstrytostudyand(levrl(ipvaccineincontrolofABinfec

4、tion,includinginactivedwholecellvaccine,outmembranevesiclesvaccine,recombinantproteinsubunitvaccine,capsularpolysaccharidecandidatevaccineandcombinedvaccine.ThisarticlesummarizedthenewprogressinthestudyofABvaccine.Keywords:Acinetobacterbaumannii(AR)；Inactivedwholecellvaccine；Outmembranevesicles；Reco

5、mbinantproteinsubunitvaccine；Capsularpolysaccharidecandidatevaccine；Combinedvaccine鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii,AB)為一種非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌。近年來,AB越來越多地引起醫(yī)院感染暴發(fā)，如呼吸機相關(guān)性肺炎、菌血癥和尿路感染，特另I是在重癥監(jiān)護病房(intensivecareunit,ICU)中更常見，這些感染不僅延長住院時間,嚴(yán)重時還可導(dǎo)致病人死亡UF。因該菌對濕熱、紫外線及化學(xué)消毒劑有較強抵抗力，常規(guī)消毒劑只能抑制其生長，而不能將其殺滅,加之在抗

6、生素的選擇壓力下，不可避免地產(chǎn)生大扯多耐藥菌株，這些耐藥菌株已成為當(dāng)前醫(yī)院感染的棘手問題，亟需尋求新型治療藥物或其他干預(yù)措施來對抗這種細菌I】。由于新的抗生素研制緩慢，而AB耐藥性發(fā)展迅速,研制安全高效的AB疫苗，是有效防治AB感染的新途徑。因此，現(xiàn)就AB疫苗的研究進展綜述如下。作者簡介:郭三君(1990)，女，在讀碩士研究生，主要從事鮑顯不動桿菌亞單位疫苗研究。通信作者：謝勇恩，教授，E-mail：cbyxye03691滅活全菌體疫苗滅活全菌體(inactivedwholecell,IWC)疫苗是對病毒或細慎進行培養(yǎng)，用加熱或化學(xué)試劑(如福爾馬林)將其滅活，但保留其抗原性而制備的疫苗。有研究

7、表明,AB的IWC疫苗動物免疫接種后，能有效預(yù)防AB的攻擊感染66】。SHU等測試一種來自抗生素暴露的多重耐藥(multidrug-resistant,MDR)AB(I-M28-47-II4)的IWC疫苗，并與相同MDRAB株的滅活非抗生素暴露的IWC疫苗(I-M28-47)相比，以確定這種新開發(fā)的候選疫苗是否可增強對AB的保護性免疫力，特別是針對MDR株。結(jié)果表明，與I-M28-47接種相比，接種I-M28-47-114刺激產(chǎn)生了更強的免疫應(yīng)答，同時還介導(dǎo)了對MDRAB更好的清除或殺菌作用。據(jù)文獻5-8報道,MCCONNEII和KUOLEE等通過制備IWC對小鼠的主動和被動免疫，也獲得了較好

8、的免疫保護效應(yīng)。IWC疫苗具有將細菌的多種抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的優(yōu)點，使用抗生素暴露的IWC疫苗能刺激產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答，同時有望解決AB多重耐藥的問題。1WC疫苗還具有制備相對容易，且成本低廉等優(yōu)點，但其蛋白成分復(fù)雜，安全性問題仍需解決。2外膜囊泡外膜囊泡(outermembranevesicles,OMVs)是由大最致病性革蘭陰性細菌細胞包膜所釋放的直徑20-200nm的球形囊泡'，由外膜蛋A(outermembraneprotein,Omp)、周質(zhì)蛋白及一系列與宿主組織粘連、侵襲有關(guān)的毒性因子組成“°),其中外膜蛋白包括0mpA、0mpC、0mpF等,周質(zhì)蛋白包括AcrA

9、和堿性磷酸酶。OMVs已被證實參與DNA片段、自溶素、細胞毒素、毒力因子和其他生物分子的轉(zhuǎn)移，可在細菌發(fā)病機制中起重要作用""'KWON等頃研究表明，AB的臨床分離菌株在休外生長過程中分泌了OMVs。MCCONNELL等*首次使用ABOMVs制備疫苗免疫小鼠，檢測到高滴度血清特異性抗體IgM和IgG,同時檢測到IgG亞型IgGlJgG2c,提示ABOMVs同時激活了Th2和Thl免疫途徑。分別使用AB標(biāo)準(zhǔn)萌株ATCC19606.臨床分離菌株AB-154及泛耐藥臨床分離株AB113-16攻擊OMVs免疫的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn),OMVs免疫小鼠脾臟細菌載量較對照組明顯下降，血

10、漿炎癥細胞因子(IL-lJL-6)含量亦明顯低于對照組，小鼠存活率高達90%100%,6OMVs雖能誘導(dǎo)產(chǎn)生較強的免疫保護性，但由于其制備過程繁瑣，包含大量的細菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)，且來源于不同菌株的OMVs,其抗原異質(zhì)性較大,交叉免疫保護效應(yīng)較弱，使其臨床應(yīng)用價值具有很大的局限性。3重組蛋白亞單位疫苗AB重組蛋白亞單位疫苗具有成分單一、重復(fù)性好，易于控制細菌內(nèi)毒素含量等優(yōu)點，在動物體內(nèi)的研究取得了較好的免疫效果，為研制安全高效的預(yù)防感染或治療性疫苗奠定了基礎(chǔ)，是目前國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。目前研究較多的AB重組蛋白亞單位疫苗主要包括:三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白、生物

11、膜形成相關(guān)蛋白和外膜核酸酶等。隨著研究的不斷深入，-些新的蛋白亞單位疫苗候選靶分子也被陸續(xù)發(fā)現(xiàn),如外膜蛋白(FilF、Omp22、OmpK,、Fkib、Omppl及OmpW等)。3.1三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白AB三聚體自轉(zhuǎn)運蛋閂(trimcricautotransporterprolein,Ata)是一種表面自體轉(zhuǎn)運蛋白，與細胞外基質(zhì)/基膜蛋白結(jié)合并有助于生物膜的形成，同時它還介導(dǎo)了AB對IV型固定化膠原的黏附及致病力的形成BENTANCOR等時制備了重組Ata蛋白的抗體.結(jié)果顯示，抗Ata抗體具有產(chǎn)生抗黏、殺菌、調(diào)理吞噬和抵抗AB攻擊感染的能力，表明Ata可作為AB亞單位疫苗研究的重要候選靶分子。3

12、.2生物膜形成相關(guān)蛋白生物膜形成相關(guān)蛋白(biofilmassociatedprotein,Bap)是一種在革蘭陰性和革蘭陽性細菌生物膜形成過程中起重要作用的高分子多結(jié)構(gòu)域蛋白'旻沖。生物膜形成被認(rèn)為是AB的重要致病特征，特別是在呼吸機相關(guān)性肺炎和導(dǎo)管相關(guān)尿路感染的情況下，它有利于細菌在惡劣環(huán)境中存活2打。ab307-0294萌株的Bap蛋白包含8621個氨基酸，是迄今為止最大的細菌蛋白質(zhì)之一，也是酸性最強的細菌蛋白質(zhì)之一(等電點為2.9)Nf),其分子結(jié)構(gòu)中包含多個串聯(lián)的重復(fù)區(qū)域，大小從70至104個氨基酸不等。通過對數(shù)百種菌株分析發(fā)現(xiàn),ABBap具有高度多態(tài)性，中央重復(fù)區(qū)域具有多樣

13、化的結(jié)構(gòu)，重復(fù)單元的類型和數(shù)量在不同曲株中存在差異。AB對不同抗生素類的耐藥性主要由Bap介導(dǎo)，所以制備Bap疫苗至關(guān)重要SEFID1等心將銅綠假單胞菌鞭毛蛋白N末端基因(-terminalregionofPseudomonasaeruginosaflagel-lin)與擁有Bap保守區(qū)域的pET28a(+)載體相連接,形成重組體,并導(dǎo)入E.coliBI21(DE3)中表達、分離、純化得到重組蛋白；再用重組蛋白免疫小鼠.顯示鞭毛蛋白增強了B叩的免疫原性，導(dǎo)致血清特異性抗體IgG滴度增加;進行AB攻擊后，用重組蛋白免疫的小鼠存活率為80%,實驗組內(nèi)臟器官(如肝臟、脾、肺)帶菌量低于對照組。這種以

14、細菌鞭毛蛋白作為Bap疫苗佐劑的免疫方案可為AB疫苗的研究提供參考。3.3外膜核酸酶外膜核酸酶(outermembranenu-clease)是AB外膜中的-種蛋白質(zhì)，由于其具有核酸酶活性，因而被稱為外膜核酸酶。革蘭陰性細菌和革蘭陽性細菌均能產(chǎn)生外膜核酸酶，可能與細菌致病力及在惡劣環(huán)境中存活有關(guān)。據(jù)報道，當(dāng)人體處于感染期時，血清中可檢測到抗核酸酶抗體,且這種抗體在臨床上也可用于疾病的診斷營-捫。GARG等首先利用生物信息學(xué)軟件對AB外膜核酸酶的分子結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)其具有候選疫苗分子的所有特征，如外膜定位、高黏附素概率(0.53)、僅有一個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)、與人類蛋白質(zhì)同源性極低、有多個人白細胞抗

15、原(humanleukocyteantigen,HLA)限制性的T、B細胞識別表位等。分析40株臨床分離的AB菌株發(fā)現(xiàn),其外膜核酸酶同源性達100%o進一步利用PCR擴增外膜核酸酶基因，經(jīng)克隆表達、提取并純化，得到相對分子質(zhì)量為90000的重組蛋白，用完全/不完全福氏佐劑乳化重組蛋白后免疫小鼠，在第一次加強免疫后即收獲高滴度(>10')的抗體，表明外膜核酸酶具有很強的免疫原性,能誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答，且促炎因子(IL-6和TNF-a)水平明顯降低，而抗炎因子(IL-10)明顯升高。同時將收獲的抗血清免疫小鼠再給予小鼠致死劑量的AB攻擊感染，發(fā)現(xiàn)小鼠存活率達40%。外膜核酸酶是一種外

16、膜蛋白，具有很強的免疫原性、只有一個跨膜螺旋，便于重組表達和純化，與人/鼠蛋白同源性極低,可有效的避免自身免疫，與其他候選疫苗相比具有較大的優(yōu)勢-30】，但仍需進一步從多方面來評估外膜核酸酶的免疫保護作用，如對其他動物模型(敗血癥)、動物物種以及接種劑量等進行研究。3.4新發(fā)現(xiàn)的蛋白亞單位疫苗候選耙分子FilFFilF是AB中一種未知功能的外膜蛋白。SINGH等】研究發(fā)現(xiàn)，在AB標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606中有一種外膜非特異性的假定菌毛裝配蛋白，將其命名為FilF。該蛋白含有641個氨基酸,其中有20個氨基酸是定位于外膜的信號肽。PCR擴增FilF基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET-28a-FilF導(dǎo)入E

17、.coliBL21(DE3)中表達、提取并純化，得到FilF重組蛋白與佐劑組成的疫苗，經(jīng)皮下注射免疫小鼠，能誘導(dǎo)特異性抗體IgG的產(chǎn)生(抗體滴度>64000),并明顯降低促炎因子(IL-6和TNF-a)的水平，給予致死劑量的AB攻擊感染，小鼠肺組織細菌載量比對照組明顯降低，小鼠存活率達50%,表明FilF具有抗AB感染的免疫保護作用。3.4.1 Omp22Omp22是從ABOMVs中發(fā)現(xiàn)的相對分子質(zhì)量為22350的一種外膜蛋白，故命名0mp22oHUANG等&研究發(fā)現(xiàn)，在AB不同菌株之間Omp22同源性高達95%,是一種具有高度保守性的抗原蛋白。用不同劑量的Omp22重組蛋白免疫

18、小鼠，發(fā)現(xiàn)實驗組不僅檢測到高滴度的IgG抗體，其抵抗AB攻擊的能力亦大大增強,攻擊后24h小鼠存活率達100%,此時對照組小鼠已全部死亡。在細胞毒性試驗方面，顯示ABOmp22蛋向?qū)549和293FT細胞僅有輕微的增殖抑制作用，幾乎不存在毒性。在這項研究中Omp22被證實具有高度的保守性、較強的免疫原性和免疫保護性。因此，它是一種有希望的抗原靶分子,可用于AB疫苗的進一步研究。3.4.2 OmpK、Fkib和Omppl研究發(fā)現(xiàn)，14個AB基因組序列中，有2752個同源的核心基因。利用蛋白質(zhì)組學(xué)信息和生物信息學(xué)等技術(shù)篩選出13個蛋白為候選疫苗分子靶標(biāo)，最后選擇并克隆了3個抗原基因(OmpK、F

19、k原、Omppl)o分別用重組OmpK,Fkib和Omppl蛋白免疫小鼠后，能夠檢測到高滴度的特異性抗體，在AB攻擊試驗中,對小鼠AB肺炎模型起到了不同程度的保護作用3】。3.4.3 OmpWOmpW也是一種未知其功能的蛋白質(zhì)。HUANG等在AB標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17978外膜上發(fā)現(xiàn)一種含有183個氨基酸的外膜蛋白OmpW,其在不同菌種之間的同源性達到91%0重組OmpW的主動免疫和被動免疫均能有效的保護小鼠免受AB的感染，但用純化的OmpW蛋白與肺腺癌細胞(A549)及人胚腎細胞(293FT)共同孵育，發(fā)現(xiàn)其對兩種細胞均有不同程度的增殖抑制作用。提示OmpW毒性太強,而使其成為候選疫苗靶分子的

20、可能性大大降低，其毒性作用的機制還有待進一步研究。4莢膜多糖候選疫苗莢膜多糖(capsularpolysaccharide)具有作為疫苗候選分子的諸多特征，如廣泛暴露于細菌表面，可刺激宿主產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng),在細菌的侵襲和致病中起重要作用以YANG等地研究發(fā)現(xiàn),AB臨床菌株SK44與ATCC17978菌株莢膜多糖生物合成相關(guān)基因位點,在核甘酸水平上具有99%的一致性，而相關(guān)錨定蛋白的同源性超過95%；將SK44菌株的莢膜多糖與TiterMax佐劑按1:1的比例混勻后，通過微創(chuàng)手術(shù)的方法注入新西蘭大白兔的脾臟，收獲抗血清，顯示ABSK44菌株的莢膜多糖抗體具有較強的免疫保護性;免疫斑點試驗顯示，

21、在554株臨床分離的AB菌株中有62%能與SK44莢膜多糖抗體發(fā)生反應(yīng)，表明其對異源菌株有交叉保護的可能性°此外,AB307-0294菌株的K1莢膜多糖也被作為疫苗候選分子進行了研究。RUSSO等】研究發(fā)現(xiàn),AB307-0294菌株的K1莢膜多糖沒有引起人體自身免疫反應(yīng)的交叉表位。用純化后的K1莢膜多糖肌肉免疫CD1小鼠,檢測結(jié)果顯示K1莢膜多糖具有明顯的免疫原性。使用針對AB的K1莢膜多糖的單克隆抗體(monoclonalantibody,MeAb)13D6來確定100株AB菌株的K1莢膜多糖的血清陽性率，結(jié)果顯示,收集的AB分離株中有13%對13D6血清反應(yīng)陽性。在嗜中性粒細胞介

22、導(dǎo)的殺菌試驗中，與K1莢膜多糖表達陰性的菊株相比，13D6可明顯增強中性粒細胞對K1莢膜多糖陽性菌株的殺菌活性。在大鼠軟組織感染模型中，分別用ABK1陽性菌株和K1陰性菌株進行攻擊，在細菌攻擊24h后，用13D6進行治療，檢測到兩種菌株的菌落形成單位（colony-formingunits,CFU）o與對照組相比，用McAbl3D6治療顯著降低AB3O7-O294（K1陽性菌株）的生長/存活率，與AB979（K1陰性菌株）相比則不受McAhl3D6治療的影響，即英膜多糖的抗體對ABK1陽性菌株感染具有潛在治療效果。雖然針對不同的血清型可能需要制備相應(yīng)的特異性抗體,但面對日益增多的耐藥菌株，以莢

23、膜多糖為靶點的被動免疫治療仍可為AB的防治帶來希望。5聯(lián)合疫苗將多種抗原組分聯(lián)合運用或?qū)MVs與重組外膜蛋白疫苗聯(lián)合運用形成聯(lián)合疫苗，可能是提高AB候選疫苗免疫效應(yīng)的策略之一。BADMASTI等叫將AB外膜囊泡OMV和重:組Bap（17M）聯(lián)合免疫小鼠，結(jié)果顯示，小鼠體液和細胞免疫反應(yīng)被同時激活，產(chǎn)生了充分的免疫保護效應(yīng)；與OMV或Bap”#）單獨免疫組相比，聯(lián)合免疫組小鼠受到AB攻擊感染后的存活率顯著提高，脾組織細萌載量明顯低于QMV或Bap（M5）單獨免疫組，表明多組分候選疫苗聯(lián)合免疫，能更有效地激活Thl和Th2免疫應(yīng)答,為小鼠提供更強的免疫保護作用。6結(jié)語在有限的藥物選擇和高死亡率面

24、前，治療耐藥AB感染而臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)3。接種疫苗是最有效的感染控制措施之一網(wǎng)】。目前由于生物信息學(xué)、基因組學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)的快速發(fā)展，大大促進了AB疫苗的研究，從早期的滅活全菌疫苗到最新的利用反向疫苗學(xué)方法篩選靶抗原，給我們更加有針對性地研究抗AB的疫苗帶來了希望。目前，多個研究證明：IWC疫苗和OMVs疫苗具有良好的免疫原性和免疫保護性，其免疫的小鼠均能抵抗AB的感染和侵襲，但由于其存在滅活不全及內(nèi)毒素殘留等缺點，致使不能被安全而廣泛的應(yīng)用。因此，人們把研究的熱點轉(zhuǎn)向AB的亞單位疫苗。雖然亞單位疫苗避免了滅活不全帶來的安全問題，但單個重組蛋白構(gòu)成的亞單位疫苗可能存在免疫保護不足，交

25、叉免疫保護作用不強等缺點，因此,探討將多種候選蛋白分子聯(lián)合使用，并設(shè)計合理免疫方案，或研制包含多個優(yōu)勢抗原表位的多亞單位疫苗，是今后研究的重要方向。由于AB基因組及抗原表位存在一定的多樣性和不穩(wěn)定性，構(gòu)建抗原覆蓋率廣、結(jié)構(gòu)完善、產(chǎn)生高效價抗體和免疫保護效應(yīng)疫苗的任務(wù)依然十分艱巨，仍需不斷地探索和深入研究。參考文獻G0NZALEZ-V1LL0IUAAM,VALVERDE-GARDUNOV.Antibiotic-resistantAcinelobaciertiaumanniiincreasingsucceMremainsachallengeasanosocomialpalhogenJj.JBath

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