擬南芥基因克隆的策略與途徑

1、1 / 13擬南芥基因克隆的策略與途徑擬南芥(Arabidopsis thaliana)是一種模式植物，具有基因組小(125 Mbp)、生長周期短等特點(diǎn)，而且基因組測序差不多完成( The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。同時，擬南芥屬十字花科(Cruciferae )，具有高等植物的一般特點(diǎn)，擬 南芥研究中所取得成果專門容易用于其它高等植物包括農(nóng)作物 的研究，產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)效益，特不是十字花科中還有許多重要 的經(jīng)濟(jì)作物，與人類的生產(chǎn)生活緊密相關(guān)，因此目前擬南芥的研究越來越多地受到國際植物學(xué)及各國政府的重視?；?gene)是遺傳物質(zhì)的最差不多單位,

2、也是所有生命活動的基 礎(chǔ)。不論要揭示某個基因的功能，依舊要改變某個基因的功能，都必須首先將所要研究的基因克隆出來。 特定基因的克隆是整個 基因工程或分子生物學(xué)的起點(diǎn)。 本文就基因克隆的幾種常用方法 介紹如下。1、圖位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposedby Alan Coulson of the Universityof Cambridge in1986, Gene isolated by this method is based on fun cti onal genes inthe gen

3、ome has a relatively stable loci, i n theuse of genetic linkage analysis abnormalities ofor chromosomal2 / 13separate groups will queue into the chromosome of a specific location,By constructing high-density molecular linkage map, to find molecularmarkers tightly linked with the aimed gene, continue

4、d to narrow thecandidate region and then clone the gene and to clarify its functionand biochemical mechanisms. 圖位克隆( map-based clonig )又稱定位克隆( positoinal cloning )，1986 年首先由劍橋大學(xué)的 Alan Coulson提出。用 該方法分離基因是依照功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的 基因座，在利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因佇 到染色體的 1 個具體位置的基礎(chǔ)上， 通過構(gòu)建高密度的分子連鎖 圖，找到與目的基因緊密連鎖的分

5、子標(biāo)記， 不斷縮小候選區(qū)域進(jìn) 而克隆該基因，并闡明其功能和生化機(jī)制。 用該方法分離基因是依照目的基因在染色體上的位置進(jìn)行的， 無 需預(yù)先明白基因的 DNA 序列，也無需預(yù)先明白其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān) 信息。它是通過分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定 突變表型的遺傳基礎(chǔ)。 近幾年來隨著擬南芥基因組測序工作的完3 / 13成，各種分子標(biāo)記的日趨豐富和各種數(shù)據(jù)庫的完善，在擬南芥中克隆一個基因所需要的努力差不多大大減少了（圖1 ）。MiAlUif-eerfDINAandvlafibli?mark-BTDuild phynK.ral mnip (VAG& orcofimhdsSiDavaFop mnk

6、orTrom YACa Or cCKOrrwdENO ONAEguONfi! kr mxl出gvre a variableClEunc and匚omplomantalhen cfenoo Beqtrenclmgi目前完成整個擬南芥的圖位克隆過程大約需要一年時刻。在那個過程中，我們從篩選突變體開始，逐漸找到和表型相關(guān)的基因。這和反向遺傳學(xué)（reverse genetics ）的方法正好相反。圖 位克隆能實(shí)現(xiàn)， 關(guān)鍵在于全基因組測序打算的完成和各種分子標(biāo) 記的發(fā)覺。這些數(shù)據(jù)被儲存在專門的數(shù)據(jù)庫中（表 1）（ Lukowitz等，2000 ）。表 1 擬南芥網(wǎng)絡(luò)資源1995Total effort:

7、a to h pe raon -yeairfiKey巖p甘inmap-baeddoningiprocsss2002Total曰n口rt:MHperson-yearloirwlJirri rTwitfwiulrmarkar Is -availLiblHFhy&icaJmap-nxin-tsiChoose martwira from Crecxidatabasal-dfrnl ify rmniclicinlA IrofnC-ai-D BfcsqgiiQd!OeaQirt penprirnd-rs ironnCO4TJ, ItiEs-n丹!科ijqnc專4 / 13網(wǎng)站網(wǎng)址Supplemental

8、material for thispaper/methods/ppsuppl.htmlNottingham Stock Centre（U.K.）http:/nasc.nott.ac.uk/Recombinant Inbred maphttp:/nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlOhio Stock Center （ U.S.A.）/aims/TAIR database* ， homepageRecombinant

9、Inbred map（mirror site ）/cgi-bin/maps/RiintromapCAPS markers/aboutcaps.htmlSequence table/cgi-bin/maps/Seqtable.plSNP collection/SNPs.htmlCEREON collection ofpolymorphisms/cer

10、eonSSLP markers/SSLP_info/SSLP.htmlTIGR, genome annotations/tdb/athl/htmls/index.htmlDatabase of Ler sequences/tdb/atgenome/Ler.htmlKasuza DNA Researchnstitute ， genomeannotationshttp:/www.kazusa.or.jp/kaos/MIPS genome annotationshttp:/we

11、bsvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposonnsertionshttp:/www.jic.bbsrc.ac.uk/sainsbury-lab/jonathan-jones/jjhome.htm*注：The Arabidopsis Information Resource（ TAIR）在擬南芥中的圖位克隆，在專門大程度上得益于對 Col-0 生態(tài)型測序的完成，因?yàn)樗窃谘芯繑M南芥時最常用的生態(tài)型。 實(shí)現(xiàn)基因圖位克隆的關(guān)鍵是篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。 實(shí)質(zhì)上，分子標(biāo)記是一個特異的 DNA 片段或能夠檢出的等位基因，

12、 對其有效地利用即可達(dá)到圖位克隆基因之目的。迄今為止，已有幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)記的篩選（ Wang 等，2000）。其中最為 常用的是簡單序列長度多態(tài)性（SSLPS 和單核苷酸多態(tài)性（SNPS5 / 13SSLP 是基于 PCR 勺分子標(biāo)記，在擬南芥基因組中有較多分布，而且是共顯性的，它的檢測特不直接，然而我們需要設(shè)計(jì)引 物來檢測假定的 SSLP 標(biāo)記；對 SNPS 標(biāo)記的檢測也比較直接， 它 是擬南芥不同生態(tài)型之間基因組中的單個核苷酸的差不，這些差不的核苷酸通常位于非編碼區(qū)域（Peters 等，2003 ）。最常見 的用于檢測 SNPs 標(biāo)記的方法要緊是剪切擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS，它也是

13、基于 PCF 的。另外，一種更為有效的方法衍生的 CAPS dCAPS （ Nam 等, 1989 ； Michaels 和 Amasino，1998）可把任何已知的點(diǎn)突變作為分子標(biāo)記， 只要在 PCR 是引入不配對 的引物，使擴(kuò)增的序列在一個生態(tài)型中具有限制性酶切位點(diǎn)，而在另一生態(tài)型中沒有，以形成多態(tài)性。圖位克隆法隨著相關(guān)配套技術(shù)（序列數(shù)據(jù)庫、分子標(biāo)記等）的日漸成熟，許多擬南芥及一些農(nóng)作物的基因已被成功的克?。ū?2）。表 2 用圖位克隆方法得到的擬南芥及一些農(nóng)作物的基因基因突變表型基因同源序列AB13脫落酸不敏感玉米轉(zhuǎn)錄子FID3降低亞油酸飽和度細(xì)菌去飽和酸酶AXR1生長素抗性泛素 N 端

14、活性酶ETR1乙烯抗性雙因子調(diào)節(jié)子ABI1脫落酸不敏感鈣調(diào)蛋白磷酸化酶DET1黃化損傷反應(yīng)新核蛋白RPS2抗病新型富含亮氨酸的蛋白酶RPM1抗病激酶RSW1纖維素合成酶細(xì)胞色素 P450 家系ZLL調(diào)節(jié)中莖分生細(xì)胞胚胎發(fā)育蛋白PRT1抑制胞間蛋白降解操縱植物 N 端代謝Torn adol植株短化6 / 13IFL1正常的維管束間纖維分化受阻亮氨酸拉鏈蛋白ARA1樹膠醛糖激酶活性喪失半乳糖激酶基因家族VTC2維生素 C 合成不足果蠅蛋白 CG3552 線蟲蛋白 C10F3.4 （功能未知）AST種皮花青苷斑點(diǎn)花青苷生物合成途徑中的二氫黃酮醇-4-還原酶本文擬對圖位克隆的研究進(jìn)展做一介紹，以期對植物遺傳育種和分子生物學(xué)研究有所關(guān)心。2 圖位克隆的一般過程因?yàn)橛辛藬M南芥的基因組序列和高密度的遺傳標(biāo)記，圖位克隆過程就變得相對直接。 圖 2 例舉了一種高效的擬南芥圖位克隆 方法。從基于 Col-0 和 Ler遺傳背景的突變體動身，我們有可能 在大約一年時刻內(nèi)找出與那個突變相關(guān)的基因，這其中要緊耗時刻的是五個植物 （擬南芥） 的生長周期 （我們假定每個周期為兩 個月） 。