滲漉法提取丹參脂溶性部位的工藝研究

1、滲漉法提取丹參脂溶性部位的工藝研究    【摘要】  目的探討丹參飲片中采用滲漉法提取脂溶性部位的最佳工藝條件。方法以丹參酮A和隱丹參酮的含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提取工藝全面優(yōu)選，并用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定其含量。結(jié)果最佳乙醇滲漉工藝為：藥材粉碎至綠豆粒大，用15倍量95%乙醇冷浸24 h后，滲漉速度3 ml/min。結(jié)論采用滲漉法提取丹參中脂溶性部位，操作簡(jiǎn)便，方法可行，降低了生產(chǎn)成本，提高了藥材利用率，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 【關(guān)鍵詞】  丹參； 正交實(shí)驗(yàn)； 丹參酮A； 隱丹參酮Abstra

2、ct：ObjectiveTo study the best extraction method of the liposolubility active principles of Rhizoma Salviae Miltiorrhizae.MethodsThe extraction process was studied by orthogonal design with the contents of Tanshinone A and cryptotanshinone determined by RP-HPLC as indexResultsThe best extraction cond

3、ition of liposolubility part was A3B1C2D2. That is to say, adding fifteen-times 95% alcohol, after 24 hours cold-soaking, percolateing with 3 ml/min.ConclusionThe extraction method for Rhizoma Salviae Miltiorrhizae can save time and energy and be suitable for the modern productionKey words：Salvia mi

4、ltiorrhiza;  Orthogonal design;   Tanshinone A;   Cryptotanshinone     丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。論文論文參考網(wǎng)味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛淤止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功效，用于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、?Y瘕積聚、胸腹刺痛、瘡瘍腫痛、心煩不眠、肝脾腫大、心絞痛等病癥。    丹參水溶性成分主要有丹參素以及丹參酚酸類，對(duì)這一部分的研究較多。丹參的脂溶性成分主要為丹

5、參酮類化合物，主要成分有丹參酮、丹參酮A、隱丹參酮、二氫丹參酮等，具有天然抗氧化活性、天然心血管藥理作用以及抗菌消炎作用，還具有明顯的抗腫瘤作用。1  器材    Aglient1100系列液相色譜儀（美國(guó)惠普公司）；丹參酮、隱丹參酮對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；丹參飲片（南京本草藥店），經(jīng)自我鑒定為丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的根。2  方法與結(jié)果2.1  丹參提取脂溶性成分指標(biāo)的建立2.1.1  干膏率測(cè)定參照2005年版中國(guó)藥典附錄XA浸出物測(cè)定法，精密量取相當(dāng)于丹參5 g的藥液，置于已干燥

6、恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105干燥3 h，移于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計(jì)算干膏收率，干膏收率（%）=干膏重量/丹參重量×100%。2.1.2  丹參酮A、隱丹參酮的含量測(cè)定預(yù)試發(fā)現(xiàn)，由于丹參中丹酚酸類成分在波長(zhǎng)268 nm處有著較強(qiáng)的紫外吸收，在進(jìn)行提取工藝考察時(shí)，許多工藝在脂溶性成分被提出時(shí)，水溶性成分同時(shí)被提出，從而使UV法測(cè)定總丹參酮含量的方法在提取工藝考察過程中很不精確，故通過使用HPLC測(cè)定丹參酮A以及隱丹參酮的含量，對(duì)丹參脂溶性部位的提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。    色譜條件：色譜柱為Scienhome Kro

7、masilC18(150 mm×4.6 mm)及預(yù)柱， 流動(dòng)相為甲醇-水(7525 )，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫30，流速0.8 ml /min，理論板數(shù)以丹參酮A，隱丹參酮計(jì)均不低于2 000。圖譜見圖12。圖1  隱丹參酮、丹參酮A的色譜圖（略）               圖2  樣品色譜圖（略）          丹參酮A儲(chǔ)備液

8、的制備：精密稱取用五氧化二磷干燥5h的丹參酮A對(duì)照品4.82 mg置50 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。    隱丹參酮儲(chǔ)備液的制備：精密稱取用五氧化二磷干燥5 h的隱丹參酮對(duì)照品4.83 mg置25 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。    混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密量取2 ml丹參酮A儲(chǔ)備液和1 ml隱丹參酮儲(chǔ)備液置5 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，最終濃度為丹參酮A 38.56 g/ml，隱丹參酮38.64 g/ml。     標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)

9、品溶液2, 6, 10, 15，20 l依次進(jìn)樣，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖、峰面積值，并以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X(g)回歸，結(jié)果可見：丹參酮A標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=7 083.3X-17.59(R=0.999 9)，線性范圍為0.077 12 0.771 2 g。    隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=6 356.5X-11.28 (R=1)，線性范圍為0.077 280.772 8 g。    精密度實(shí)驗(yàn)：取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣10 l 5次，測(cè)得峰面積值，丹參酮A的平均峰面積為2 723.0，RSD=0.13%；隱丹參酮的平均峰面積為2 431

10、.1，RSD=0.15%，表明使用該儀器精密度良好。論文參考網(wǎng)    穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：對(duì)同一樣品溶液分別在放置0,1，2，3，6，9，12 h后進(jìn)樣，測(cè)得峰面積值，結(jié)果表明，丹參酮ARSD=0.73%, 隱丹參酮RSD=0.62%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。    樣品的測(cè)定：將丹參提取液過濾，濾液合并后，加入乙醇定容至500 ml。從中精密量取2 ml用甲醇定容至10 ml容量瓶中，微孔濾膜過濾，進(jìn)樣10 l，按外標(biāo)法計(jì)算其中丹參酮A以及隱丹參酮含量。2.2  脂溶性部位提取工藝研究滲漉是常用的浸出方法之一，滲漉時(shí)，溶劑滲入藥

11、材的細(xì)胞中溶解大量的可溶性物質(zhì)之后，濃度增加，密度增大而向下移動(dòng)，上層的浸取溶劑或稀浸液置換位置，造成良好的濃度差，使擴(kuò)散較好地自然進(jìn)行，故其浸出效果優(yōu)于浸漬法，提取也較完全，而且省去了分離浸出液的時(shí)間和操作，故采用滲漉法來研究丹參中脂溶性部位的提取。    在滲漉法提取脂溶性部位工藝研究過程中，擬對(duì)乙醇濃度、粉碎度、滲漉總的乙醇倍量以及滲漉流速的不同水平進(jìn)行研究，以便尋找出最佳滲漉提取法。具體因素水平的設(shè)計(jì)詳見表1。精確稱量每份20 g，先用適量乙醇潤(rùn)濕后，待藥材充分膨脹后裝入自制滲漉筒中，裝完后先向筒內(nèi)加入適量各濃度的乙醇溶液至高出藥粉表面1 cm，加蓋冷浸2

12、4 h后再按L9(34)設(shè)定具體工作安排表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定并計(jì)算出干膏收率、丹參酮A得量（mg/g）、隱丹參酮得量（mg/g）、丹參酮A和隱丹參酮總量（mg/g），實(shí)驗(yàn)結(jié)果用極差法及方差法進(jìn)行分析詳見表24。表1  丹參滲漉提取正交設(shè)計(jì)因素水平表（略）表2  丹參滲漉正交安排表（略）表3  丹參酮A的得量方差分析表（略）表4  隱丹參酮的得量方差分析表（略）根據(jù)對(duì)方差和極差的綜合分析可以發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度是丹參滲漉工藝的最主要影響因素，故95%為最佳滲漉濃度，收集滲漉液量作為次要影響因素，雖然通過直觀分析，以20倍量為最佳，但是由于15倍量的滲漉結(jié)果與20倍量

13、相差很小，從節(jié)約溶劑方面考慮，采取收集15倍量滲漉液；實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)粉在滲漉過程中，容易造成孔隙堵塞，故選用粗粉為佳，而綠豆粒大小雖然效果相對(duì)差一些，但并無顯著差異，且有利于后續(xù)水提工藝的進(jìn)行，故藥材粉碎度采用綠豆粒大；滲漉速度對(duì)工藝的影響最小，且3 ml?kg-1?min-1與1 ml?kg-1?min-1對(duì)有效成分的提取量相差較小，而5 ml?kg-1?ml-1提取量相對(duì)較小，從節(jié)約時(shí)間和提高提取率方面考慮，采用3 ml?kg-1?min-1為佳。綜上所述，我們篩選的最佳乙醇滲漉工藝為A3B1C2D2，即藥材粉碎至綠豆粒大，用適量乙醇潤(rùn)濕后，待藥材充分膨脹后裝入滲漉筒中，裝完后先向筒內(nèi)加入適

14、量各濃度的乙醇溶液至高出藥粉表面1 cm，加蓋冷浸24 h后每1 000 g藥材以95%乙醇的按3 ml/min的速度滲漉，收集15倍量乙醇體積的滲漉液即得。由于A因素已經(jīng)是95%乙醇，大生產(chǎn)上無法使用更高濃度的乙醇，故關(guān)于此因素的追加實(shí)驗(yàn)舍去。     采用以上確定的最佳條件進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即以20 g丹參藥材，按條件收集750 ml體積的滲漉液，測(cè)定得丹參酮IIA的得率為2.77 mg/g生藥，隱丹參酮的得率為1.81 mg/g生藥，總量為4.58 mg/g生藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)中的最佳工藝相比相差較小，故從時(shí)間、能源各方面綜合考慮，認(rèn)為此工藝為最佳工藝。3

15、  討論    丹參藥材由于原植物的屬種不同，產(chǎn)地不同，其所含總丹參酮的量有較大差異。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，丹參藥材中總丹參酮的含量在0.03% 1.49%不等。目前對(duì)總丹參酮的含量要求尚無具體規(guī)定。2005版中國(guó)藥典規(guī)定1丹參以丹參酮A為指標(biāo)，含量不得少于0.2%。本研究考慮到丹參酮A和隱丹參酮在總酮中所占比例均比較大，所以本實(shí)驗(yàn)以丹參酮A和隱丹參酮作為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此計(jì)算脂溶性部位的含量。    直觀分析和方差分析結(jié)果表明各因素對(duì)脂溶性部位收率的影響大小依次為乙醇濃度>滲漉液收集量>粉碎度>滲漉流速。其中乙醇濃度對(duì)丹參酮和隱丹參酮收率有顯著影響，其他因素為誤差項(xiàng)。根據(jù)縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本的原則，由此得出丹參滲濾法提取的最佳工藝為藥材粉碎至綠豆粒大，