用mRNA差異顯示法尋找人絨毛膜上皮癌與孕早期絨毛組織間的差

1、    用mRNA差異顯示法尋找人絨毛膜上皮癌與 孕早期絨毛組織間的差異基因        【摘要】目的尋找人絨毛膜上皮癌(JAR)與孕早期絨毛組織間的差異基因。方法采用mRNA差異顯示法(mRNA differential display PCR, DD-PCR)，即分別提取正常孕早期絨毛及絨毛膜上皮癌的總RNA，在oligodT15作用下分別合成相應(yīng)的cDNA，并以其為模板利用試劑盒中的20對(duì)引物組合和-32PdATP，Taq酶等進(jìn)行PCR，將兩者的PCR產(chǎn)物在

2、6%變性聚丙烯酰胺凝膠(PAG)上電泳，放射自顯影后尋找兩者間的差異片段，回收差異片段進(jìn)行二次PCR，對(duì)二次PCR產(chǎn)物先采用反雜交法初步篩選后再用Northern Blot鑒定。結(jié)果從PAG上切下32條差異條帶，經(jīng)反雜交初步篩選出11個(gè)陽性片段，對(duì)11個(gè)陽性片段分別做Northern Blot鑒定，其中1個(gè)片段(T26)的基因長(zhǎng)度約1.2kb，其在絨毛膜上皮癌中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常絨毛組織。結(jié)論T26基因片段可能是絨癌相關(guān)基因?！娟P(guān)鍵詞】mRNA差異顯示法(DD-PCR)；絨毛膜上皮癌(JAR)；絨毛；人【中分類號(hào)】R737.33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】0529-1356(2000)04- m

3、RNA DIFFERENTIAL DISPLAY POLYMERASE CHAINREACTION WAS USED TO IDENTIFY DIFFERENTIALGENES BETWEEN CHORIOCARCINOMA AND THE FIRSTTRIMESTER VILLI TISSUE IN HUMANSHI Gui-zhiGAO Ying-mao（Department of Histology and Embryology of Shandong Medical University, Jinan 250012）GU Xiao-songLIU Mei（Department of N

4、euroscience Institute of Nantong Medical University,Nantong 226001,China）WANG Bao-heng（Department of Technology of High People's Court of Shandong Province, Jinan 250014, China）【Abstract】Objective To identify differential genes between choriocarcinoma and the first trimester villi tissue in huma

5、n. Methods mRNA differential display PCR(DD-PCR) was used. First both total RNAs were isolated and reversely transcribed into cDNAs respectively with oligodT15, then these cDNAs were gone through PCR by using primer pairs from DeltaTM Differential Display kit, -32PdATP and Taq DNA Polymerase. The pr

6、oducts of PCR were run on 6% denaturing polyacrylamide gels(PAG) and autoradiograms were examined to find the differential bands between both gels. The differential bands were reamplified using the same PCR condition as before. Reverse dot blot procedures and Northern analysis were used to identify

7、the bands. Results From PAG 32 differential bands of choriocarcinoma were cut, from which 11 bands were identified through reverse dot blot procedure. Northern analysis showed that one band(T26) was much stronger in choriocarcinoma than in normal villi, its mRNA size is about 1.2kb. Conclusion Diffe

8、rential band T26 may have relevance with choriocarcinoma. 【Key words】 DD-PCR; Choriocarcinoma(JAR);Villi;Human胚胎孕早期絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)育與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及侵蝕性等方面有許多相似之處1。由于各種因素的影響，滋養(yǎng)層細(xì)胞過度增殖可惡化發(fā)展為絨毛膜上皮癌。目前對(duì)其發(fā)生機(jī)理尚不清楚。為了從分子水平上研究其致病機(jī)理，本研究采用近年發(fā)展起來的差異顯示PCR技術(shù)2，比較了胚胎孕早期絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞與絨毛膜上皮癌(JAR)之間的基因表達(dá)差異，尤其是尋找腫瘤相關(guān)基因，進(jìn)而對(duì)腫瘤的發(fā)生機(jī)理研究提供幫

9、助。材料和方法1.標(biāo)本來源正常孕早期胎盤絨毛組織(孕50d至60d，自停經(jīng)算起)取自南通醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院人流室；絨毛膜上皮癌細(xì)胞株(JAR cell line)購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所。2.提取總RNA及電泳鑒定2.1提取總RNA：按TrizolTM Reagent (GIBCO)說明進(jìn)行。取100mg左右正常流產(chǎn)絨毛組織及培養(yǎng)的絨癌細(xì)胞，分別加入Trizol反應(yīng)液1.5ml勻漿，室溫靜置5min，加入0.3ml氯仿，充分震蕩15s，室溫靜置2min，12 000×g 4 離心15min。取上清，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min，12 000×g 4離心10min，棄上清

10、，加入1.5ml 75%乙醇混旋沉淀，7 500×g 4離心5min，棄上清，晾干后，加入適量DEPC水溶解(65促溶15min)。測(cè)A 260/A 280，當(dāng)比值大于1.7時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，以保證RNA的高純度；根據(jù)A 260值計(jì)算RNA含量，RNA含量(g/L)=A 260×RNA稀釋倍數(shù)×40 mg/L÷1 000。2.2RNA電泳：用1×甲醛凝膠電泳緩沖液(20mmol/L MOPS， 8mmol/L 乙酸鈉，1mmol/L EDTA)配制1%瓊脂糖凝膠。調(diào)整兩者RNA的濃度相同，取RNA溶液4.5l(約30g)；依次加入5×

11、甲醛凝膠電泳緩沖液4.0l；甲醛3.5l；去離子甲酰胺10l,65變性15min，冰浴5min。加溴化乙錠(EB，1g/L)1l，凝膠上樣緩沖液2l，混合后加入凝膠樣品孔中。調(diào)整電場(chǎng)強(qiáng)度5V/cm，電泳23h。使用SH-100像分析系統(tǒng)(上海四星生物公司)攝片記錄結(jié)果后轉(zhuǎn)尼龍膜。2.3轉(zhuǎn)膜：按毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移至與凝膠大小一致的尼龍膜上，80真空干烤2h，4真空保存。3.逆轉(zhuǎn)錄正常絨毛及絨癌標(biāo)本分別做一相應(yīng)副管。調(diào)整上述RNA含量至1g/L，取2l為模板，加入Oligo(dT)15引物(10mol/L，上海植物生理研究所合成)1l；焦碳酸二乙酯(DEPC)水3.5l，混勻70 1

12、0min，冰浴，依次加入下述試劑：10×反應(yīng)緩沖液1l；MgCl2(25 mmol/L)1l; dNTP混合物(10 mmol/L)0.5l;0.1mol/L二硫蘇糖醇(DTT)1l;Superscript RT （2×108UL，GIBCO）0.5l，混勻后離心，42 50min,70 15min，20儲(chǔ)存。4.PCR在每一反應(yīng)管中加入如下物質(zhì)：10×反應(yīng)緩沖液2l;dNTP(2mmol/L)0.5l;DeltaTM Differential Display Kit(CLONETECH)中錨定引物T1T9之一(20mol/L，例如引物T8序列：5-CATTATG

13、CTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3'，引物T1T9除3端2個(gè)堿基不同外，余相同)1l，隨機(jī)引物P1P10之一(20mol/L，例如引物P10序列：5-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3'，引物P1P10除3端9個(gè)堿基不同外余相同)1l，110稀釋的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5l；滅菌雙蒸水13l；Taq酶(2×106U/L，Bio star international, Canada)0.5l;-32PdATP(3?000Ci/mmol,北京市亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司)0.5l。循環(huán)參數(shù)如下：第1個(gè)循環(huán)：94 5min，40 5min，68 5mi

14、n；第23個(gè)循環(huán)：94 30s，40 30s，68 5min；第436個(gè)循環(huán)：94 20s，60 30s；68 2min；最后68延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后即刻電泳。5. 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)及放射自顯影5.1配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠：用1×TBE電泳緩沖液(89mmol/L Tris堿；89mmol/L硼酸；2mmol/L EDTA)配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：N，N-亞甲雙丙烯酰胺191；7 mmol/L尿素)，用前取50ml加臨時(shí)配制的25%過硫酸銨(AP)50l，N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)50l?；靹蚝蠊嗳氚仓煤玫臏y(cè)序板內(nèi)(Bio-Ra

15、d Ltd.)室溫凝聚3h。5.2電泳：將測(cè)序板裝入電泳儀中，灌入1×TBE緩沖液，設(shè)置恒定溫度為50，100W功率預(yù)電泳30min；停止預(yù)電泳，取前述PCR產(chǎn)物加等體積聚丙烯酰胺凝膠上樣緩沖液98%去離子甲酰胺；20mmol/LEDTA(pH 8.0)；0.05%二甲苯青；0.05%溴酚藍(lán)，94 2min，上樣。按預(yù)電泳條件電泳3h至二甲苯青達(dá)電泳槽底。5.3放射自顯影：將凝膠干燥，70曝光適當(dāng)時(shí)間，顯影，定影。尋找正常絨毛組織與絨癌細(xì)胞之間的差異條帶。6.差異片段的回收及二次PCR6.1回收差異片段：從凝膠上精確切下差異條帶，加50l滅菌雙蒸水，100煮沸15min，將上清轉(zhuǎn)至新

16、的離心管中，-20儲(chǔ)存。6.2二次PCR：在0.5ml PCR管中建立擴(kuò)增體系，除模板(回收的DNA)為3l，不加同位素外，余條件同第1次PCR。7.點(diǎn)雜交法(反雜交)初步篩選陽性差異條帶7.1點(diǎn)膜：取二次PCR產(chǎn)物及陽性對(duì)照(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，GAPDH)，分別加等體積A液(0.8mmol/L NaOH,20mmol/L EDTA),100 10min，0冰浴，依次序?qū)APDH及所有2次PCR產(chǎn)物分別點(diǎn)尼龍膜；加樣后每孔用0.4mmol/L NaOH 500l漂洗，2×SSC稍加漂洗后晾干，室溫保存。7.2探針標(biāo)記：依照Prime-a-GeneR Labeling Syst

17、em(Promega)試劑盒中說明進(jìn)行。取絨癌逆轉(zhuǎn)錄后的第1鏈4l(約20ng)，94 3min，0冰浴中加入下列物質(zhì)：dGTP,dTTP,dATP混合物2l、10g/L BSA 1.0l,5×標(biāo)記緩沖液(Kit提供，內(nèi)含隨機(jī)寡脫氧核苷酸)5.0l、-32PdCTP(3 000Ci/mmol)3l,ddH2O 9.5l,Klenow酶(2×106IU/L)0.5l?；靹蚝笾?5水浴1h。95 3min終止反應(yīng)，0冰浴。7.3雜交：在雜交瓶中加入5ml預(yù)雜交液(1×Denhardt, 0.2% SDS,0.1g/L鮭魚精子DNA，6×SSC)，將尼龍膜放入

18、，42預(yù)雜交3h，加入標(biāo)記探針，42雜交過夜，次日洗膜(2×SSC，0.1%SDS室溫15min，0.2×SSC，0.1%SDS 55 15min)并進(jìn)行放射自顯影。8.Northern blot鑒定陽性差異條帶的大小方法基本同上述點(diǎn)雜交，將轉(zhuǎn)了RNA的尼龍膜置于雜交瓶中，對(duì)點(diǎn)雜交篩出的陽性差異條帶的二次PCR產(chǎn)物標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。結(jié)果1.RNA電泳結(jié)果TRIZOL法提取的正常絨毛組織與絨癌的總RNA經(jīng)甲醛變性膠電泳，皆可見清晰的18S，28S兩條帶，兩者相應(yīng)條帶的亮度基本一致，說明兩者總RNA的上樣量基本一樣，可作為下面Northern blot結(jié)果的內(nèi)參，亦說明提取的總

19、RNA完整性良好；左側(cè)標(biāo)尺顯示了18S，28S兩條帶距加樣孔的距離，可作為下面Northern blot結(jié)果的分子量參照.(1，N、T分別表示正常絨毛及絨癌，下同)2. mRNA差異顯示結(jié)果以試劑盒中20對(duì)隨機(jī)引物組合(例如T1，P1；T2，P1等)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行PAGE放射自顯影，共尋找出32條絨癌差異條帶，即在絨癌中顯示，在正常絨毛中不顯示。如2顯示其中的一條差異條帶結(jié)果。3.點(diǎn)雜交結(jié)果將絨癌總RNA逆轉(zhuǎn)錄后的cNDA標(biāo)記探針，與點(diǎn)于尼龍膜上的32條絨癌差異條帶的二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，結(jié)果顯示11個(gè)呈陽性(3，AK)，左上方為陽性對(duì)照GAPDH。4.Northern blot結(jié)果將上述

20、點(diǎn)雜交中呈陽性結(jié)果的片段(二次PCR產(chǎn)物)分別標(biāo)記探針進(jìn)行Northern blot雜交，其中BK的雜交信號(hào)不清晰，條帶彌散，只有A的雜交信號(hào)顯著，即4中T26差異條帶；根據(jù)1中測(cè)量的RNA電泳時(shí)18S、28S到加樣孔的距離，以18S(2 366bp),28S(6 333bp)片段大小的對(duì)數(shù)值對(duì)兩者的遷移距離作，用所得曲線計(jì)算從凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜后通過雜交所檢出的RNA分子的大小3；據(jù)此推測(cè)該陽性條帶約1.2kb，其在絨癌中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常絨毛；在前方有一約4.4kb的條帶，可能是由于mRNA前體的剪接不同所致。    1RNA的甲醛變性膠電泳結(jié)果，可見清

21、晰的18S、28S兩條帶及其距加樣孔的距離。Fig.1 Electrophoresis of RNA on gel containing formaldehyde, showing 18S,28S two bands.    2顯示引物T8、P10 PCR擴(kuò)增后進(jìn)行PAGE電泳及放射自顯影結(jié)果；1，2泳道中的顯示條帶大部分相同；箭頭所示條帶T26只在絨癌中顯示，在正常絨毛中不顯示；3，4泳道是1，2泳道的相應(yīng)副管結(jié)果，該中3泳道條帶顯影較1泳道深是由于上樣量稍多所致。Fig.2 Autoradiograms of amplified -32PdATP l

22、abeled PCR product using primer pairs of T8,P10(after electrophoresis in 6% polyacrylam-ide gels)are shown above, T26(arrow) only appears in T instead of N;lane 3,4 are the correspond auxiliary results of lane 1,2.    3點(diǎn)雜交結(jié)果。Fig.3 The results of dot blot.    4

23、差異片段T26的northern blot結(jié)果。Fig.4 Northern blot analysis of differential band T26.討論本實(shí)驗(yàn)采用的差異顯示PCR方法是1992年哈佛大學(xué)的Peng Liang和Arthurb Pardee首先發(fā)明的，其較經(jīng)典的差示雜交和消減雜交更為簡(jiǎn)便、快捷，更有可能得到陽性結(jié)果，而且可進(jìn)行2種以上樣本的多重比較。以我們的工作看，DD-PCR的確是分離差異基因的有效方法，但其不足是假陽性條帶過多，為了減少假陽性片段的產(chǎn)生，我們?cè)谠S多方面加以改進(jìn)：1.在cDNA合成時(shí)，我們使用oligodT15引物一次性將所有的mRNA全部逆轉(zhuǎn)錄為cDN

24、A，減少了通常采用12種oligodT12MN錨定引物逆轉(zhuǎn)錄的繁瑣，并且合成的cDNA質(zhì)量并不受影響4，5。2.利用Clontech公司優(yōu)化的DeltaTM Differential Display Kit中引物進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其包括10種隨機(jī)引物(P1P10；25bp)和9種oligodT錨定引物(T1T9；29pb)，其有許多優(yōu)點(diǎn)：采用試劑盒中較長(zhǎng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，先啟動(dòng)3個(gè)低嚴(yán)謹(jǐn)度循環(huán)，后采用33個(gè)高嚴(yán)謹(jǐn)度循環(huán)以提高反應(yīng)的特異性同時(shí)降低非特異性擴(kuò)增，從而減少了假陽性條帶的產(chǎn)生。我們隨機(jī)選取了DD-PCR kit中的部分引物組合進(jìn)行差示PCR，從PAG凝膠中共分離了32個(gè)有良好重復(fù)

25、性的差異條帶。3.從聚丙烯酰胺凝膠上切取的差異條帶由于多種原因的影響，并非所有的差異條帶都是特異性基因表達(dá)產(chǎn)物，其中相當(dāng)一部分是假陽性，因此需要對(duì)它們進(jìn)行鑒定，篩選出真陽性差異條帶6，7。經(jīng)典的方法是將32個(gè)二次PCR產(chǎn)物分別標(biāo)記探針，與比較標(biāo)本的RNA做Northern blot雜交，排除假陽性條帶后克隆；或者分別將32個(gè)差異條帶的二次PCR產(chǎn)物克隆，再做Northern blot雜交鑒定。由于差異條帶比較多，上述方法的工作量都比較大且繁瑣，因此我們先采用反雜交(點(diǎn)雜交)法8對(duì)差異條帶進(jìn)行初步篩選，即將所有差示條帶的二次PCR產(chǎn)物點(diǎn)尼龍膜，將絨癌總RNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA標(biāo)記探針與尼龍膜進(jìn)行

26、雜交，用高嚴(yán)格度條件洗膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有11個(gè)陽性(34.4%)、21個(gè)陰性(65.6%)；該方法國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。其中的陰性條帶可能是由于PCR高度敏感，擴(kuò)增出一些稀有mRNA片段，因而在雜交時(shí)由于量少而顯示不出來，有一部分可能的確是非特異性擴(kuò)增的假陽性帶。我們對(duì)點(diǎn)雜交中陽性片段的二次PCR產(chǎn)物標(biāo)記探針，與正常絨毛及絨癌的RNA進(jìn)行Northern blot雜交確定陽性差異片段的基因大小，發(fā)現(xiàn)T26差異片段在絨癌中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常絨毛，相應(yīng)基因約1.2kb大小，在其前方尚有一約4.4kb的條帶，可能是由于mRNA前體的剪接不同所致.由目前結(jié)果可推測(cè)T26基因與絨癌的發(fā)生可能相關(guān)；但尚需對(duì)該片段

27、克隆測(cè)序并進(jìn)一步了解全長(zhǎng)基因及其功能，以深入認(rèn)識(shí)其與絨癌的關(guān)系。本文14見插第16頁附：差異顯示PCR引物具體序列a:10×90l Arbitrary primers(20mol/L)b:9×90l Oligo(dT) primers(20mol/L)P1：5-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGGA-3P2：5-ATTAACCCTCACTAAATCGGTCATAG-3P3：5-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTGG-3P4：5-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTAG-3P5：5-ATTAACCCTCACTAAAGATCTGACTG-3P6

28、：5-ATTAACCCTCACT0AAATGCTGGGTG-3P7：5-ATTAACCCTCACTAAATGCTGTATG-3P8：5-ATTAACCCTCACTAAATGGAGCTGG-3P9：5-ATTAACCCTCACTAAATGTGGCAGG-3P10：5-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3T1：5-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAA-3T2：5-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAC-3T3：5-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAG-3T4：5-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTT

29、TTTTCA-3T5：5-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCC-3T6：5-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCG-3T7：5-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGA-3T8：5-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3T9：5-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGG-3【基金項(xiàng)目】衛(wèi)生部科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(96-1-199)【作者簡(jiǎn)介】史桂芝(1973)，女(漢族)，山東梁山人，博士，現(xiàn)在濟(jì)南市婦幼保健院工作，郵政編碼 250012史桂芝（山東醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，濟(jì)南

30、250012）高英茂（山東醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)教研室，濟(jì)南 250012）顧曉松（南通醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，南通 226001）劉梅（南通醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，南通 226001）王寶恒（山東省高級(jí)人民法院技術(shù)室，濟(jì)南 250014）參考文獻(xiàn)1Susan JF,Cui TY,Zhang L,et al. Adhesive and degradative properties of human placental cytotrophoblast cells in vitroJ.J Cell Biol,1989,109(2):891-902.2Liang P,Pardee AB. Differential