一個新的小麥非生物脅迫誘導基因的克隆及表達特性

1、一個新的小麥非生物脅迫誘導基因的克隆及表達特性張瑞越1,2，徐兆師1，李連城1，陳 明1，馬有志1(1中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/農(nóng)業(yè)部作物遺傳育種重點開放實驗室，北京100081；2江蘇淮陰師范學院生物系，淮安223300)摘要：【目的】水分脅迫和低溫是制約植物生長發(fā)育的重要限制因子，研究植物感知、傳遞脅迫信號，并對重要的基因進行克隆對改良作物的抗性有重要意義。本試驗的目的是克隆與水分脅迫相關的基因，通過基因的功能進一步了解植物的抗旱機制，并為抗逆育種提供候選基因?！痉椒ā吭囼瀾檬删w原位雜交技術從小麥旱脅迫cDNA文庫中克隆了一個水分脅迫誘導基因片段W89。用5-RACE和RT-PCR

2、方法，獲得了W89基因的全長序列?！窘Y果】W89全長cDNA為2 392 bp，其中，編碼區(qū)長1 896 bp，編碼631個氨基酸。Southern雜交表明，W89是一個單拷貝基因。RT-PCR結果表明，W89受干旱、低溫和ABA的誘導。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)W89有一個DUF248保守區(qū)（pfam03141），包含一個具有SAM （Sterile Alpha Motif）結合基序的甲基轉移酶區(qū)。同源性分析發(fā)現(xiàn)W89與一個水稻干旱誘導蛋白（BAD67956）的同源性為66%，推測W89可能是一個新的小麥干旱誘導的基因。【結論】根據(jù)甲基轉移酶和SAM結合基序的功能，推測W89的SAM結合基序可能與其

3、它蛋白或轉錄因子相互作用調(diào)控植物脅迫基因的表達，并且可能在干旱脅迫的早期調(diào)控信號的轉導。關鍵詞：小麥；水分脅迫；低溫；基因克隆 Cloning and Expression Analysis of a Novel Abiotic Stress-induced Wheat Genes ZHANG Rui-yue1,2, XU Zhao-shi1, LI Lian-cheng1, CHEN Ming1, MA You-zhi1(1 Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture, Institute of

4、Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 Agricultural College, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052)Abstract: 【Objective】Water stress and cold stress are important factors restricting plant growth. However, there is little knowledge on the function of str

5、ess-responsive genes in plant. Therefore, it is necessary to clone some important genes to study the mechanism of plant adaptation to abiotic stress for the improvement of plant resistance. Our objective is the cloning of water stress-related genes, and providing candidate genes for stress-resisted

6、plant breeding. 【Method】A putative water stress-induced gene, W89, was cloned from the cDNA library of drought-treated wheat seedlings by phage hybridization in situ. Its entire length was obtained using 5-rapid amplification of cDNA ends (RACE) and reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT

7、-PCR). 【Result】The full-length cDNA of W89 consists of 2 392 bp and contains a 1 896 bp open reading frame (ORF) encoding a 631 amino acid protein. Southern blot analysis indicated that W89 was a single-copy gene. RT-PCR analysis revealed that the expression of W89 was unregulated by drought, cold a

8、nd abscisic acid (ABA). Amino acid sequence analysis discovered that W89 had a conserved region of DUF248 (pfam03141), which contained a methyltransferase domain with a sterile alpha motif (SAM)-binding motif. Phylogenetic analysis showed that W89 was 66% identical to Oryza sativa dehydration-respon

9、sive protein (BAD67956). It was supposed that W89 was a novel dehydration-responsive protein encoding gene. 【Conclusion】Based on the functions of methyltransferase and SAM-binding motif, the SAM-binding motif of W89 was supposed to be connected with other proteins or transcription factors to transdu

10、ce stress signals and finally regulate the expression of stress-responsive genes on the early stage of drought stress. Key words: Wheat; Water stress; Cold; Gene cloning 0 引言【研究意義】干旱可直接導致細胞缺水，高鹽、低溫脅迫可改變植物體內(nèi)滲透平衡，導致植物吸水困難。研究植物感知、傳遞脅迫信號，并對重要的基因進行克隆對進一步了解植物的抗旱機制和改良作物的抗性有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物細胞缺水引起一系列生理生化變化，如物

11、質(zhì)代謝失調(diào)、活性氧增多、代謝毒物積累等1,2。水分脅迫還可改變植物內(nèi)源激素的平衡，減少促進生長的激素，增加抑制或延緩生長的激素，從而抑制植物的生長發(fā)育3。在逆境脅迫條件下，植物細胞感知并傳遞脅迫信號，引發(fā)一系列生理、生化反應來維持自身的水分狀況，避免或減輕缺水對細胞造成的危害4。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多基因的表達受干旱、低溫和高鹽脅迫的誘導，產(chǎn)生一些重要的功能蛋白和調(diào)控蛋白，來維持細胞各種代謝活動的正常進行46。在干旱狀態(tài)下，大豆LEA蛋白（GmPM16）與糖相互作用形成緊密的玻璃狀基質(zhì)減少細胞的損 傷7，豌豆LEA蛋白（PsLEAm）可保護線粒體基質(zhì)酶（如延胡索酸酶和硫氰酸酶）8。水通道蛋白可幫助水分通

12、過細胞膜，對擬南芥質(zhì)膜水通道蛋白PIPs突變體研究發(fā)現(xiàn)，在正常和干旱狀態(tài)下，突變體和對照沒有明顯的差別，但復水后對照的電導率、蒸騰速率和葉片水勢都明顯高于突變體，表明PIPs對植物干旱脅迫后的恢復起重要作用9。調(diào)控蛋白如轉錄因子、蛋白激酶等，在脅迫信號轉導和基因表達調(diào)控過程中起重要作用3, 4, 10。從擬南芥中分離的AREB1和AREB2受旱、高鹽和ABA誘導，激活啟動子區(qū)含有ABRE元件的基因的表達，如RD22、AtADH等11。水稻OsDREBL受低溫誘導，但不受ABA、鹽和干旱誘導12；小麥TaDREB1受低溫、鹽和旱誘導，它們調(diào)控具有DRE元件的基因的表達13。蛋白激酶參與調(diào)節(jié)細胞的

13、新陳代謝、轉錄和對各種刺激產(chǎn)生應答反應等。CIPK3受低溫、鹽和ABA誘導表達14，CDPK可激活脅迫誘導基因的表達，增強植物抗性15。對模式植物擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)38種功能基因與脫水應答有關16，在水分脅迫下存在著兩種信號轉導途徑，即ABA依賴型和非依賴型1, 5。這兩種途徑可能在下游信號的識別和轉導過程中共存，擬南芥RD29A的表達在干旱脅迫的最初幾小時不依賴于ABA，但在后期階段卻依賴于ABA2, 17?！颈狙芯康那腥朦c】植物的水分脅迫應答涉及極為復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。目前對有關水分脅迫誘導基因的功能了解不多，植物的抗旱機制尚有待進一步研究?？寺∨c水分脅迫相關的基因?qū)ρ芯恐参锏乃置{迫適應機理以

14、及提高對水分脅迫的抗性有重要意義。【擬解決的關鍵問題】筆者從小麥的cDNA文庫中克隆了一個與水分脅迫相關的基因W89，RT-PCR結果表明，W89受干旱、低溫和ABA的誘導。該基因的克隆為水分脅迫育種提供候選基因。1 材料與方法1.1 材料將普通小麥品種小白麥播種在苗床上，2024生長10 d左右后進行各種處理，處理時間分別為2 h、5 h和10 h。將小麥幼苗置于4培養(yǎng)箱進行低溫處理；置于2%的NaCl溶液中進行鹽處理；將水培的小麥幼苗取出吸干水分，置于干燥的濾紙上進行干旱處理；用200 molL-1的ABA溶液噴施小麥幼苗進行ABA處理。1.2 cDNA文庫的構建及W89全長cDNA的克隆

15、采用生長10 d左右的小白麥幼苗干旱處理2 h后，用Poly(A) Quik mRNA Isolation Kit（Stratagene）分離mRNA，按Stratagene公司的HybriZAP-2.1 XP Library Construction Kit和HybriZAP-2.1 XP cDNA Synthesis Kit 構建cDNA文庫。庫容量為10106 pfu。用噬菌體原位雜交技術進行cDNA文庫的篩選，65雜交12 h以上，用洗脫液（2SSC/0.5% SDS）65洗2次，每次15 min，將獲得的陽性克隆測序。結合5-RACE和RT-PCR方法，獲得了第89號克隆的全長cDN

16、A序列，命名為W89，GenBank注冊號為AY987028。1.3 同源性分析通過檢索GenBank和利用DNAMAN軟件進行多重序列比較和同源性分析。1.4 Southern雜交應用SDS-酚氯仿法提取小麥基因組DNA，分別用BamHI、EcoRV和EcoRI37過夜酶切等量DNA（每泳道10 g DNA），用0.8%的瓊脂糖膠電泳分離后轉到尼龍膜上。用-32P-dCTP標記的W89基因的3端（PCR擴增獲得，長度370 bp）作為探針進行Southern雜交，用洗液（2SSC/0.1% SDS）65洗脫后，壓X-光片。1.5 半定量RT-PCR分析從不同脅迫處理的小麥材料中提取總RNA。

17、取1 g總RNA作為模板進行RT-PCR，所用引物為89RTF: 5-TCAGCATCTACCAGGACAGGTG-3，89RTR：5-CATCGCGTCACACCTAGTTACC-3。擴增條件為：942 min，94 30 s，60 45 s，72 45 s，30個循環(huán)，72 7 min。以Actin基因作為內(nèi)標。2 結果與分析2.1 W89全長cDNA的克隆和同源性分析利用噬菌體原位雜交技術，從干旱誘導的小麥cDNA噬菌體文庫中篩選到1個1 059 bp 的cDNA克隆W89。用5-RACE和RT-PCR方法，獲得了W89基因的全長序列。W89全長cDNA為2 392 bp，其中編碼區(qū)長1

18、 896 bp，編碼631個氨基酸，預測分子量約為71.79 kD，等電點為7.67。5非編碼區(qū)為160 bp，3非編碼區(qū)為336 bp（圖1）。在GenBank搜索比對發(fā)現(xiàn)W89有1個DUF248保守區(qū)（pfam03141，460669 AA），DUF248保守區(qū)通常由幾個串聯(lián)序列組成甲基轉移酶區(qū)，有些甲基轉移酶區(qū)包含1個SAM結合基序18, 19。W89包含SAM結合基序，據(jù)報道，SAM結合基序在蛋白與蛋白互作中起重要的作用25。從GenBank中搜索到5個與W89氨基酸序列同源性較高的蛋白。用DNAMAN軟件分析結果顯示，W89與1個水稻旱誘導蛋白（BAD67956）的同源性為66%（圖

19、2），推測W89是1個新的小麥旱誘導基因。2.2 Southern雜交分析為了檢測W89基因的拷貝數(shù)，分別用BamHI、EcoRV和EcoRI酶切小麥基因組DNA，以-32P-dCTP標記W89基因的3端作為探針進行了Southern雜交。雜交結果顯示BamHI、EcoRV和EcoRI酶切的DNA泳帶都各有一條雜交帶（圖3）。因此，推測W89基因是一個單拷貝基因。2.3 W89的表達特性分析采用RT-PCR法檢測W89在不同脅迫條件下的表達特性。結果表明，W89在不同處理條件下的表達水平是不同的（圖4）。當用ABA處理后，W89的表達量逐漸增大，到5 h達最高水平而后逐漸減少。在干旱處理下，W

20、89在2 h表達最強，而后逐漸降低；在低溫處理下，W89表達逐漸增強到5 h達最高，隨后表達量降低。W89的轉錄水平不受高鹽的影響。因此，W89是一個依賴于受干旱、低溫和ABA調(diào)控的基因。3 討論 DNA甲基化在植物的發(fā)育和分化中起著調(diào)控基因表達的作用。甲基轉移酶可以通過催化DNA的GC二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子的甲基化來抑制或關閉基因的表達20。在環(huán)境脅迫下，植物調(diào)節(jié)甲基轉移酶的活性，能夠更高效地修復環(huán)境脅迫引起的蛋白質(zhì)損傷21。將肌醇O-甲基轉移酶轉入煙草中提高了植株的抗旱耐鹽能力，并且轉基因植株脅迫后的恢復速度要比野生型植株快22。在干旱、高鹽和ABA處理下，小麥的天冬氨酰異構甲基轉移

21、酶在小麥幼苗中被誘導激活21。小麥的N-甲基轉移酶和黑麥的O-甲基轉移酶都受低溫的調(diào)控23, 24。分析發(fā)現(xiàn)W89內(nèi)部的甲基轉移酶區(qū)包含一個SAM結合基序。SAM結合基序存在于許多真核調(diào)節(jié)蛋白中，如酪氨酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、轉錄因子等，是蛋白相互作用的位點，多個蛋白亞基通過SAM結合基序相互作用形成聚合體，調(diào)控信號的轉導或轉錄抑制25。由此推測W89基因的SAM結合基序可能與其它蛋白或轉錄因子相作用，調(diào)控植物在逆境中的基因表達，提高植物的抗逆性。許多基因能被ABA、干旱、高鹽和低溫同時或某幾個脅迫因子誘導表達。RD29A可同時被ABA、干旱、高鹽和低溫誘導4, 17；CBF1、CBF2、

22、CBF3被低溫誘導，不受ABA和干旱的誘導；而CBF4受干旱和ABA的誘導，卻不受低溫的誘導26, 27。有人將擬南芥ABA應答基因劃分成9類：細胞分裂與增殖、細胞保護、防衛(wèi)與衰老、細胞信號轉導、細胞組織與起源、能量與新陳代謝、蛋白質(zhì)合成、轉錄，轉移激活和功能未知基因28。依據(jù)基因?qū)γ撍{迫反應的時間可劃分為二類，一類是脅迫發(fā)生后迅速反應，一類是脅迫發(fā)生后需一段時間后才反應。推測早期應答基因可能起保護細胞及擴大信號的作用，而后期應答基因可能起使植物適應脅迫狀態(tài)的作用6。Seki等分析旱誘導基因的表達，發(fā)現(xiàn)一類基因在干旱處理后2 h表達最強而后逐漸降低，如Rd22BP1、DREB2A，這些基因可

23、能調(diào)控信號的轉導和基因的表達，增強植物對脅迫的耐受能力2。低溫脅迫通常伴隨著脫水脅迫。并且，許多低溫誘導基因?qū)Ω珊岛虯BA也發(fā)生響應10, 17。根據(jù)W89在干旱脅迫下的表達特征（圖4），推測W89可能在早期干旱脅迫下調(diào)控信號的轉導；而低溫也誘導了W89的表達，可能是低溫引起植物生理干 1 CGCTCGCGTGAATAAATAGCGCCTCACTGCCCGGACCGGAGCTCGGGCTCACCGGAGACGCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTTCTTCAT 91 CCGTCCCGGCGCGCTGAGCTCCTACCCAGGAGAGGAGAGGAGGACGGCTTCTTCCCGACG

24、GACAGGAGCCATGGCTAAAGATTACCCAGC 1 M A K D Y P A 181 ATCTCCTAAAGCCCAGCATCTGCAAGAATCCAAGAAGCAGCGTCTCACCTACGTACTTGTGGTGAGCGCTCTCTGCGTTGCCTTCTACGT 8 S P K A Q H L Q E S K K Q R L T Y V L V V S A L C V A F Y V 271 GCTCGGGGCATGGCAGAACAGCACCATGCCGAATCCTGTGGCTGATTCGGCAATCAGCCGAGTCGACTGTGATACCGTGGCGCAGAGAGA 3

25、8 L G A W Q N S T M P N P V A D S A I S R V D C D T V A Q R D 361 CGGCTCGGTGCCGTCTTTTGCGCCTGCATCTGAGAATGTGCTCGATTTTGATGCGCACCACCAGCTGAACCTCAGTGAGACAGAGTCTGT 68 G S V P S F A P A S E N V L D F D A H H Q L N L S E T E S V 451 GGTGCAGCAGTTCCCTGCGTGCCCGCTCAATCAGAGTGAGTACACGCCATGCGAGGACCGGAAACGTGGCCGTCTG

26、TTTGACCGGGACAT 98 V Q Q F P A C P L N Q S E Y T P C E D R K R G R L F D R D M 541 GCTGATATACCGTGAGAGGCACTGCCCGGGCAAGGACGAGCAGATCCGATGCCTCATTCCAGCGCCACCAAAGTACAAGAACCCCTTCAG 128 L I Y R E R H C P G K D E Q I R C L I P A P P K Y K N P F R 631 GTGGCCGGAGAGCAGGGACGTCGCTTGGTTTGACAACATCCCTCACAAGGAGCTCAGCA

27、TTGAGAAGGCCGTGCAGAACTGGATCCGAGT 158 W P E S R D V A W F D N I P H K E L S I E K A V Q N W I R V 721 GGAGGGGAACAAGTTCCGGTTCCCCGGTGGTGGCACTATGTTTCCCCATGGCGCTGACGCGTACATTGATGAAATCAGTAAGCTCATCTC 188 E G N K F R F P G G G T M F P H G A D A Y I D E I S K L I S 811 GTTGTCGGATGGGAGGATCAGGACGGCGATCGACACGGGCT

28、GCGGGGTTGCTAGCTTTGGGGCTTACTTGCTGAAGAGGAACATCATTAC 218 L S D G R I R T A I D T G C G V A S F G A Y L L K R N I I T 901 CGTGTCGTTTGCGCCGAGGGACACACACGAAGCTCAGGTGCAATTTGCACTGGAACGTGGTGTGCCTGCCATCCTCGGGGTGATGGGATC 248 V S F A P R D T H E A Q V Q F A L E R G V P A I L G V M G S 991 AATACGGTTGCCTTATCCATCTA

29、GGGCATTTGATCTGGCTCATTGTTCACGTTGTCTGATTCCTTGGGGAGGACATGATGGACTGTACCT 278 I R L P Y P S R A F D L A H C S R C L I P W G G H D G L Y L 1081 TGCCGAGATCGATAGAATTCTAAGGCCAGGGGGCTACTGGATTCACTCGGGCCCTCCGATCAACTGGAAGACGCACCACAATGGGTGGAA308 A E I D R I L R P G G Y W I H S G P P I N W K T H H N G W K 1171 GAGG

30、GCCGAGGAAGACCTCAAGCGGGAGCAAGACAAGATTGAGGATGTCGCGAGGAGCCTTTGCTGGAATAAGGTGGCCGAGAAGGAGGA338 R A E E D L K R E Q D K I E D V A R S L C W N K V A E K E D 1261 TCTCTCCATCTGGCAGAAGCCCAAGAACCACCTTGAGTGTGCCGACATAAAAAAGAAGCATAAGATACCCCATATCTGCAAGAGTGACAA368 L S I W Q K P K N H L E C A D I K K K H K I P H I C

31、 K S D N 1351 CCCTGATGCTGCCTGGTACAAGAAGATGGAATCCTGTCTTACTCCATTGCCTGAAGTAAGCAACCAGGGATCAATCGCCGGCGGAGAGGT398 P D A A W Y K K M E S C L T P L P E V S N Q G S I A G G E V 1441 TGCGAGATGGCCAAAGAGGGCATTCACGGTGCCCCCAAGGGTTAAGAGGGGCACGATTCCGGGGATAGATGAAAAGAAGTTTGAGGATGA428 A R W P K R A F T V P P R V K R G

32、 T I P G I D E K K F E D D 1531 CATGAAGCTGTGGGAGAAGAGGTTGGCGTACTACAAACGCACCACGCCCATAGCACAGGGGAGGTACAGGAATGTGATGGACATGAATGC458 M K L W E K R L A Y Y K R T T P I A Q G R Y R N V M D M N A 1621 GAACTTGGGCGGTTTTGCCGCTTCCCTGGTTAAGTACCCTGTGTGGGTGATGAACGTCGTTCCAGTTAATTCGGATAAAGACACCCTTGG488 N L G G F A A S

33、 L V K Y P V W V M N V V P V N S D K D T L G 1711 AGCAATTTACGAGCGAGGGTTCATCGGCACTTACCAGGACTGGTGTGAAGCCTTCTCGACGTATCCGAGGACCTACGACCTTTTGCACGC518 A I Y E R G F I G T Y Q D W C E A F S T Y P R T Y D L L H A 1801 CGACAATTTGTTCAGCATCTACCAGGACAGGTGCGACATAACGGACATCCTCCTGGAGATGGACAGGATACTGAGGCCCGAGGGCACGGC5

34、48 D N L F S I Y Q D R C D I T D I L L E M D R I L R P E G T A 1891 GATCATCCGCGACACGGTCGACGTGCTCACCAAGGTCCAGGCCATAGCCCAGCGGATGCGGTGGGACAGCCGCATCCTGGACCACGAGGA578 I I R D T V D V L T K V Q A I A Q R M R W D S R I L D H E D 1981 CGGGCCCTTCAACCAGGAGAAGGTCCTCGTGGCGGTCAAGACGTACTGGACGGCCGACCCATCGGAGCACAGC

35、TGAGCTGCAGCTCTCTG608 G P F N Q E K V L V A V K T Y W T A D P S E H S * 2071 AGCTCCGAAATGGCTTGTCCGGTAACTAGGTGTGACGCGATGATGGTGTCGGTTTTCGCCATCTCGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT2161 GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAGTAAGCAGTGTGTGACCACGTGCGCAGTCGCTTGTTCCTCTCGCCTTTTTTGTCTAATTCTTTGTAGTT2251 CGGGTCGAAATGGAAACCAAAAAAATACGTCGAG

36、CAGATCATAGGTTCTTTTTAGCTTGTACGACCAGAGATTGTTACTATGTAGTACTA2341 AGATTGACTTACTGGAAAAATAGGCCTTTTACTGAAAAAAAAAAAAAAAAAA起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)用下劃線標注；DUF248保守區(qū)用下劃線標注；SAM結合基序用著重點標注The start codon (ATG) and the stop codon (TGA) were both underlined. The conserved region of DUF248 was underlined under the deduc

37、ed amino acid sequences; SAM-binding motif was emphasized with dots圖1 W89全長cDNA和推導的氨基酸序列Fig. 1 The full-length cDNA sequence and predicted amino acid sequence of W89A.B A. W89蛋白的DUF248保守區(qū)與其它相關蛋白的氨基酸序列比對分析，圖中SAM結合基序用著重點標注；B. W89全長氨基酸序列與其它相關蛋白的同源性分析。BAD67956：水稻；AAP78933：擬南芥；BAD29526：水稻；CAD41579：水稻；CAB

38、80884：擬南芥A. Amino acid sequence alignment of DUF248 conserved region of W89 with other related proteins. SAM-binding motif was emphasized with dots. B. Homology tree of W89 with other related proteins. BAD67956: Oryza sativa; AAP78933: Arabidopsis thaliana; BAD29526: O.sativa; CAD41579: O. sativa; C

39、AB80884, A. thaliana圖2 W89與其它相關蛋白的同源性分析Fig. 2 Sequence alignment of W89 with other related proteinsB EV EIB: BamHI; EV: EcoRV; EI: EcoRI圖3 以(-32P-dCTP)標記W89基因片段作為探針進行的Southern雜交Fig. 3 Southern blot analysis of W89 hybridized with -32P-dCTP-labeled W89 3-end fragment as probe0 h 2 h 5 h 10 h 干旱Drough

40、tABA高鹽Salt低溫ColdActin圖4 W89在各種脅迫處理下的表達Fig. 4 Expression of W89 under treatments of ABA, drought, salt and cold旱，誘導了W89的表達進而調(diào)控其它基因的表達提高植物的抗逆性。4 結論本研究從小麥中克隆到一個受干旱、低溫和ABA誘導的新基因。分析表明W89以單拷貝存在于基因組中，它編碼的蛋白可能與其它蛋白或轉錄因子相互作用，參與早期干旱脅迫下的信號轉導。因此本研究克隆的W89基因可能在調(diào)控植物抗逆性中起重要作用。為了更清楚地了解W89在植物逆境中的作用，筆者將采用基因敲除的方法，研究W89

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