新型巰基化合物近紅外BODIPY類熒光試劑的合成與應(yīng)用研究

1、新型航基化合物近紅外BODIP償熒光試劑的合成與應(yīng)用研究谷胱甘肽（GSH劑半胱氨酸（Cys）等小分子琉基化合物（RSH）廣泛分布于生物體中，在新陳代謝活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。作為主要的還原物質(zhì)，RSH可清除活性氧和自由基，維持機(jī)體的氧化還原平衡；RSH®可與一氧化氮（NO）反應(yīng)生成S-亞硝基硫醇（RSNO）,作為NO的“儲(chǔ)存池”，從而間接參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)RSH量出現(xiàn)異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肝損傷、阿爾茨海默病、癌癥、艾滋病等疾病。鑒于巰基化合物在生物體內(nèi)獨(dú)特的生理病理功能,檢測(cè)其在生物體內(nèi)的含量、含量變化及其動(dòng)態(tài)分布意義重大。熒光分析法因其靈敏度高、選擇性好、直觀、可視化等優(yōu)勢(shì),在化學(xué)、生命科學(xué)、

2、醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近紅外（NIRF,>600nm）熒光由于背景干擾少、組織穿透力強(qiáng)、對(duì)生物損傷小等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn),而性能優(yōu)異的有機(jī)小分子熒光試劑在近紅外熒光中的應(yīng)用最多。然而,理想的有機(jī)小分子熒光試劑仍然較少。二氟化硼-二吡咯甲烷（Borondipyrromethene,BODIPY求光團(tuán)的摩爾吸光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高，熒光不受溶劑、pH值及光照影響。因此,本論文通過在其3-、5-位引入苯乙烯基擴(kuò)大共軛體系的方式,設(shè)計(jì)合成了新型的近紅外熒光試劑1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（2-馬來酰亞胺基）-二氟化硼-二叱咯甲烷（DMDSPAB-o-M

3、）：1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-（4'-碘乙酰胺基）-二氟化硼-二叱咯甲烷（DMDSPAB-I）結(jié)合熒光光度計(jì)、高效液相色譜（HPLC）、毛細(xì)管電泳（CE）、熒光顯微鏡等分析手段，利用新合成的近紅外熒光試劑,建立了多種測(cè)定血液、細(xì)胞、組織等動(dòng)植物樣品中巰基化合物及含量變化的新方法，包括可視化同時(shí)監(jiān)測(cè)RS書口NO的熒光成像法。具體研究工作包括以下幾個(gè)方面：（1）用苯乙烯基擴(kuò)大BODIPY勺共腕體系,并以其為母體熒光團(tuán)、以馬來酰亞胺基或碘乙酰胺基為巰基化合物的識(shí)別基團(tuán),設(shè)計(jì)合成了新型的近紅外熒光生成試劑DMDSPAB-o-M近紅外熒光標(biāo)記試劑DMDSPAB-濟(jì)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)

4、表征,詳細(xì)考察了試劑及其琉基衍生產(chǎn)物的熒光分析性能。DMDSPAB-o-M光量子產(chǎn)率僅為0.005,與琉基化合物快速反應(yīng)后,熒光增強(qiáng)43倍（=0.215）。DMDSPAB-o-M衍生產(chǎn)物的激發(fā)/發(fā)射波長均為632/645nm；兩者的熒光經(jīng)激光照射120min或在pH2.0-11.0范圍內(nèi)，強(qiáng)度基本不變。DMDSPAB本身具有強(qiáng)熒光（=0.557）,其衍生產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率也高達(dá)0.560。DMDSPAB-R衍生產(chǎn)物的激發(fā)/發(fā)射波長均為620/630nm,具有與DMDSPAB-o-M衍生產(chǎn)物相同的光穩(wěn)定性，且pH適用范圍更寬。（2）基于"turn-on"型近紅外熒光試劑DMD

5、SPAB-o-Mg立了直接測(cè)定GSH勺熒光光度法。在pH9.0PBS緩沖溶液中,37衍生5min。方法的線性范圍為6-200nM,檢出限（S/N=3）為0.44nM。半胱氨酸（Cys）與GSH勺摩爾比小于1/2時(shí)不干擾，可直接測(cè)定多數(shù)樣品中的GSH小鼠全血和肝臟分析的加標(biāo)回收率在95.2%-102.6%之間。該方法無需分離，靈敏度高，選擇性好，簡(jiǎn)便快速。（3）DMDSPAB-o-M為"turn-on"型熒光試劑,脂溶性好,易透膜,易穿透組織,因此將其用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV-304）和小鼠肝臟組織中巰基化合物的熒光成像。在優(yōu)化的條件下，DMDSPAB-o-Mf細(xì)胞孵育5

6、min即可生成明亮的紅色熒光；將其注入小鼠體內(nèi)30min,肝臟組織即可觀察到較強(qiáng)熒光。對(duì)肝損傷小鼠肝臟組織成像發(fā)現(xiàn)熒光明顯減弱,表明其中巰基化物含量降低。該熒光成像法生物毒性低、無背景熒光干擾,熒光強(qiáng)度與巰基化合物水平呈正相關(guān),可快速靈敏地反映細(xì)胞或組織中巰基化合物的含量變化及空間分布,在與巰基化合物含量變化相關(guān)的生理、病理可視化研究及生物醫(yī)學(xué)診治中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。（4）RSH和NO是生物體內(nèi)關(guān)系密切、相互作用復(fù)雜的兩類生物活性分子,利用雙標(biāo)記法實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞及組織樣品中這兩類分子的同時(shí)雙色熒光成像。以DMDSPAB-o-M記RSH1,3,5,7-四甲基-8-（3',4'-二氨

7、基苯基）-二氟化硼-二毗咯甲烷（DAMB%記NO兩試劑與小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（Raw264.7）、人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）或洋蔥組織共同孵育，以590、475nm波長分別激發(fā)，同時(shí)雙色熒光成像。結(jié)果表明，與RSHlENO的單標(biāo)記成像相比，該方法能同時(shí)反映同一樣本中RSH、NO的實(shí)時(shí)分布及彼此之間的含量變化關(guān)系,更符合實(shí)際狀況,為更準(zhǔn)確、深入研究RSH、NO的生理功能及相互作用提供了直觀有效的新技術(shù)平臺(tái)。（5）DMDSPAB-I及其琉基衍生產(chǎn)物具有強(qiáng)熒光且受溶劑和pH的影響較小，非常適合柱前衍生、高效液相色譜分析。以GSH,Cys、高半月氨酸（Hcy）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、半胱氨酰

8、甘氨酸（CysGly）及青霉胺（PA）六種小分子琉基化合物為對(duì)象進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)最佳衍生條件為pH11.0Na2B4O7-NaOHg沖溶液、45、25min。在C18柱上，以甲醇/四氫味喃/水/pH2.0H3Cit-NaOH緩沖溶液（77:6:12:5,v/v/v/v）為流動(dòng)相,25min基線分離。S/N=3時(shí)，最低檢出限為0.24nM。將建立的方法用于小鼠血樣中巰基化合物的測(cè)定,加標(biāo)回收率在94.7%-104.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）小于4.8%。與已有柱前衍生HPLC&相比,近紅外熒光衍生試劑的應(yīng)用使色譜基線更平滑、樣品干擾峰更少、檢出限更低。(6)DMDSPAB-及其琉基衍生產(chǎn)物的激發(fā)波長為620/630nm,與635nm半導(dǎo)體激光器的激發(fā)波長相匹配。以DMDSPAB-為衍生試劑，建立了毛細(xì)管電泳分離-激光誘導(dǎo)熒光(CE-LIF)檢測(cè)GSHCys、Hcy、丫-谷氨酰半胱氨酸(y-GluCys)、CysGly和NA6種小分子琉基化合物的分析方法。在含有16mMpH7.0檸檬酸鈉緩沖溶液和60%(v/v)乙腈的背景電解質(zhì)中,14min可實(shí)現(xiàn)分離,檢出限(S/N=3