玻璃粘連蛋白對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化阻礙

1、玻璃粘連蛋白對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化阻礙王明明葉發(fā)剛葛銀林【摘要】 目的體外別離純化培育大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSO,研究玻璃粘連蛋白(VN在rMSC向成骨方向分化進(jìn)程中的作用.方式貼壁別離培育法別離純化rMSC觀看第一、3、五、八、10代細(xì)胞的增殖情形,并繪制誕生長曲線.選第3代細(xì)胞用以VN包被的培育板培育,每4d檢測堿性磷酸酶活性及鈣結(jié)節(jié)的形成.結(jié)果經(jīng)貼壁挑選法別離的rMS性長曲線呈S形,第3、4、5代細(xì)胞排列具有典型的漩渦狀結(jié)構(gòu)；細(xì)胞表達(dá)CD44CD90而不表達(dá)CD34用以VN包被的培育板培育12d,堿性磷酸酶染色呈陽性,硝酸銀染色顯示有鈣結(jié)節(jié)形成.結(jié)論VN有誘導(dǎo)rMSC向成骨方

2、向分化的作用.【關(guān)鍵詞】骨髓；間質(zhì)干細(xì)胞；玻璃粘連蛋白；細(xì)胞分化ABSTRACTObjectiveToisolate,purifyandcultivatetheratmesenehymalstemcells(rMSCs)invitro,andstudytheeffectofvitronectin(VN)onosteogenicdifferentiationofrMSCs.MethodsrMSCswereisolatedandpurifiedbywalladhesioncultureprocedureinvitro.Thegrowthcurveofcellproliferationwasobta

3、inedbasedontheobservationoftheproliferationstatusof1st,3rd,5th,8th,and10thgeneration.Thecellsofthe3rdgenerationwereculturedincultureplatescoatedbyVN,andcalcifyingnoduleandalkalinephosphataseALPactivitycheckedeveryfourdays.ResultsTherMSCsgrowthcurveappearredasSform,and3rd,4thand5thgenerationmanifeste

4、dastypicalwhirlpoolstructure.ThesecellsexpressedCD44andCD90,butnotCD34.Thecellsculturedfor12daysincultureplatesandcoatedwithVNshowedpositiveALPexpressionandcalcifyingnodules.ConclusionVitronectinpocessesapotentialofinducingRMSCtowardsosteogenicdifferentiation.KEYWORDSbonemarrow;mesenchymalstemcells;

5、vitronectin;celldifferentiation骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSC為骨髓中一群多能干細(xì)胞,在不同的因素誘導(dǎo)下能夠分化為不同的細(xì)胞.啟動MS8化確實(shí)切因素尚不十分清楚,周圍環(huán)境中某些可溶性誘導(dǎo)因子已被成功鑒定,而周圍不可溶性成份對成骨誘導(dǎo)的作用相對關(guān)注較少.本實(shí)驗(yàn)要緊研究組成細(xì)胞外基質(zhì)要緊成份的玻璃粘連蛋白VN在MSCJ成骨分化進(jìn)程中的作用,以探討MS成骨分化確實(shí)切因素.1材料和方式實(shí)驗(yàn)材料Wistar大鼠,2月齡,由青島市藥品查驗(yàn)所提供.VN武漢博士德生物工程,LDMEMS糖培育基GIBCO公司,胎牛血清蘭州民海生物工程,胰蛋白酶SIGMA公司,羊抗大鼠CD34FITC、CD

6、44FITC、CD90FITC北京中山生物公司實(shí)驗(yàn)方式大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞rMSC的體外別離培育取2月齡Wistar大鼠,頸椎脫臼處死,無菌條件下掏出其股骨,用LDMEW出骨髓,離心去除上清及脂肪,所得細(xì)胞懸液以X108/L的細(xì)胞密度接種于75mL培育瓶中,在含體積分?jǐn)?shù)胎牛血清LDMEMS全培育液中,37C、體積分?jǐn)?shù)CO二、飽和濕度條件下培育,3d后第一次換液,去除未貼壁細(xì)胞.以后每23d換液1次,待貼壁細(xì)胞融合90%寸,以g/L胰蛋白酶消化、傳代.貼壁細(xì)胞融合90%寸即傳代1次,傳至第3代時進(jìn)行實(shí)驗(yàn).rMSC的生長曲線繪制別離取第一、3、 五、 八、10代細(xì)胞,用g/L胰蛋白酶消化后參加LD

7、ME睡全培育液,調(diào)整細(xì)胞密度至X107/L,接種于5個24孔板,每孔加細(xì)胞懸液mL.天天每板取3孔消化,制成細(xì)胞懸液,混勻,計(jì)數(shù)并取平均值,持續(xù)9d,以時刻為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長曲線.rMSC的鑒定形態(tài)學(xué)觀看：在倒置顯微鏡下按期觀看細(xì)胞生長情形.細(xì)胞外表標(biāo)志鑒定：取第3代細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、離心,參加200wLPBS制成細(xì)胞懸液.設(shè)置陰性對照,力口入羊IgG1FITC;其他管別離加羊抗大鼠CD34FITC、CD44FITC、CD90FITC和細(xì)胞與熒光素共鈍抗體抗CD2九、CD34CD90在黑暗中孵化15min.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞外表抗原表達(dá)情形rMSC與VN共培育及相關(guān)指標(biāo)檢測在rMS

8、CWd弋3次后,將指數(shù)生長期細(xì)胞用LDMEMB細(xì)胞的密度為x103/cm2,接種于用純化的VN包被的24孔培育板中,以成骨誘導(dǎo)液為陽性對照,以含體積分?jǐn)?shù)胎牛血清LDMEMS全培育液為陰性對照,每3d換液1次,在培育至4、八、12和16d時別離進(jìn)行堿性磷酸酶染色和鈣離子沉淀測定.堿性磷酸酶染色：向培育板中加入雙蒸水配制的蔡酚AS乂溺酸鹽和FastblueRR溶液,孵育,顯微鏡下測定染料沉積情形.鈣離子沉淀的測定：用30g/L的多聚甲醛固定細(xì)胞30min,雙蒸水洗2次,暗處與50g/L的硝酸銀溶液孵育10min,雙蒸水洗后暴露于強(qiáng)光下1h,計(jì)數(shù)染色細(xì)胞沉積顆粒的數(shù)量和大小.2結(jié)果原代培育細(xì)胞12h

9、可見細(xì)胞貼壁,3d后大部份細(xì)胞貼壁,第1次換液后細(xì)胞4h貼壁,細(xì)胞呈多角形、菱形,可見集落形成；910d細(xì)胞間彼此融合達(dá)90%傳代后細(xì)胞4h貼壁,生長迅速,細(xì)胞呈較為均一的梭形、多角形,并呈漩渦狀排布.rMSC生長曲線呈S形,第35代增殖迅速,1代和8代次之,10代生長明顯減慢圖1.別離純化的細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞外表標(biāo)志CD34而強(qiáng)表達(dá)CD44CD90說明所提取、純化的細(xì)胞是MSC而不是成纖維細(xì)胞或造血干細(xì)胞.誘導(dǎo)組第8天細(xì)胞堿性磷酸酶染色可見棕黑色顆粒,第12天棕黑色顆粒明顯增多增大,提示堿性磷酸酶染色陽性,而陰性對照組無此顆粒.硝酸銀染色誘導(dǎo)組呈多量黑色顆粒,而陰性對照組無此顆粒,陽性對照組

10、顆粒更為粗大.3討論最近幾年來研究說明,MS虛一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞,特定條件下可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等分化12.體內(nèi)多種阻礙其分化的可溶性因子已被別離鑒定,如MSC在含有維生素C地塞米松、(3磷酸甘油的培育基中培育時,細(xì)胞能夠產(chǎn)生堿性磷酸酶,并具有礦化水平,具有成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性3.在最近幾年的實(shí)驗(yàn)研究中,人們過量地關(guān)注成骨基質(zhì)在MSCHt進(jìn)程中的作用,卻忽略了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合行為對其分化的阻礙.有報(bào)導(dǎo)證實(shí),膠原n在軟骨形成進(jìn)程中表達(dá)最高,而膠原I在骨化時期沉積最多4.在體外實(shí)驗(yàn)中,MSC培育于膠原I基質(zhì)上時會發(fā)生成骨分化,而且需要與膠原I結(jié)合整合素2(31的彼此

11、作用5.細(xì)胞外基質(zhì)蛋白通過結(jié)合細(xì)胞外表特異的整合素受體而阻礙細(xì)胞的生物學(xué)行為,這些受體能啟動細(xì)胞內(nèi)信號通路,操縱基因表達(dá)、細(xì)胞骨架形成和細(xì)胞形態(tài).顯然,作為細(xì)胞外基質(zhì)要緊成份的膠原在MSCM骨分化進(jìn)程中起了必然的作用.本實(shí)驗(yàn)采納全骨髓培育法,將rMSCs直接參加培育瓶中而未先進(jìn)行別離.由于rMSCs貼壁生長,而造血細(xì)胞懸浮生長,經(jīng)3代換液培育后能大體去除未貼壁細(xì)胞3.基于細(xì)胞外基質(zhì)在MS質(zhì)骨分化進(jìn)程中起必然作用,用組成細(xì)胞外基質(zhì)要緊成份的VN研究rMSCW細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合對rMSC成骨分化的阻礙,并采納堿性磷酸酶染色6、 硝酸銀染色證實(shí)成骨分化的程度.結(jié)果顯示,rMSC可與VN正常結(jié)合,并在一起

12、培育第8天顯現(xiàn)成骨分化偏向,第12天成骨分化明顯,細(xì)胞呈典型成骨細(xì)胞表型,堿性磷酸酶活性增高,硝酸銀染色顯示有大量鈣結(jié)節(jié)形成,證實(shí)rMSCW細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合可能參與了成骨分化進(jìn)程.rMSCM如何將與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)化為MSC田胞分化行為,尚需進(jìn)一步研究.【參考文獻(xiàn)】1KNIPPENBERGM,HELDERMN,DOULABIBZ,etal.AdiposetissuederivedmesenchymalstemcellsacquirebonecelllikeresponsivenesstofluidshearstressonosteogenicstimulationJ.TissueEngin,20

13、22,11(1112):17801788.2JIANGY,JAHAGIRDAFBN,REINHARDTRL,etal.PluripotencyofmesenchymalstemcellsderivedfromadultmarrowJ.Nature,2022,418:4149.3劉斌桂,李寧毅,樊功為,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培育鑒定及向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究J.齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2022,22(3):215217.4BORTELLR,BRAONELM,TASSINARIMS,etal.Geneexpressionduringendochondralbonedevelopment:evidenceforcoordinateexpressionoftransforminggrowthfactorbeta1andcollagentypeIJ.JCellBiochem,1990,44(2):