大學(xué)常規(guī)微生物實驗注意事項及思考題

1、精品文檔實驗一細菌涂片的制備及革蘭氏染色1、制備細菌染色標本時應(yīng)注意什么？涂片不要太厚，要均勻，固定的時候一定按照要求，快速，染色脫色時間要 控制好2涂片2、固定的意義何在？固定時應(yīng)注意什么問題？固定 目的是殺死細菌并使細菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法， 即將細菌涂片膜向上，通過火焰 3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變 形。此制片可用于染色。3、革蘭氏染色的原理及染色成敗的關(guān)鍵？機制：結(jié)果為陽性（紫色）和陰性（紅色）兩大類，與細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)組 成有關(guān)。細菌經(jīng)結(jié)晶紫初染和碘液媒染之后，所有細菌都染上不溶于水的結(jié) 晶紫與碘的復(fù)合物，呈深紫色；陰菌的細胞壁含脂類較多，當以95叱醇脫色

2、時，脂類被乙醇溶去，而肽聚糖少，且交聯(lián)疏松，不易收縮，在細胞壁中 形成的孔隙較大，復(fù)合物極易被乙醇溶解洗脫，最后被紅色的染料復(fù)染成紅 色；陽菌與陰菌相反，復(fù)合物不能脫出，經(jīng)紅色染料復(fù)染后仍為紫色。（堿） 結(jié)晶染色一碘媒染一酒精脫色一可脫為 G©不月為GH關(guān)鍵：革蘭氏染色四大基本步驟：實驗二培養(yǎng)基的制備1、為什么在校正培養(yǎng)基pH時，少量培養(yǎng)基時用0.1摩爾每升氫氧化鈉，而大量 時用1摩爾每升氫氧化鈉？少量培養(yǎng)基在校正時，需要的氫氧化鈉少，所以用濃度底的校正的結(jié)果會 更準確。而大量的就需要大量的，如果還用濃度低得話，結(jié)果會準確，但是 工作量極大，而換1mol/L的話，結(jié)果誤差不會很大，綜

3、合考慮：在校正大 量的培養(yǎng)基時，應(yīng)使用濃度高的。2、為什么肉湯培養(yǎng)基在高壓滅菌之前 ph要略調(diào)高些？牛肉膏中有些物質(zhì)在加熱后會分解出酸性物質(zhì)導(dǎo)致 pH下降。因此初始pH 應(yīng)比需要值高0.2左右。3、試述普通肉湯和瓊脂培養(yǎng)基的主要用途？瓊脂培養(yǎng)基是在實驗室做實驗時專門配置的，一般植物源瓊脂培養(yǎng)基適用 于培養(yǎng)真菌一類的微生物；動物源瓊脂培養(yǎng)基適用于細菌類微生物培養(yǎng)。動 物源瓊脂培養(yǎng)基主要成分與肉湯差不多，只是培養(yǎng)基可以根據(jù)實驗的要求進 行調(diào)整營養(yǎng)成分，以適應(yīng)實驗要求。瓊脂培養(yǎng)基一定會成“凍”，肉湯不一實驗三細菌分離培養(yǎng)、移植及培養(yǎng)特性觀察注意事項12、接種培養(yǎng)基時應(yīng)嚴格無菌操作，要盡一切可能防止外

4、界微生物的進入。3、選擇適宜的培養(yǎng)基，如果培養(yǎng)基選擇不當，則材料中的細菌就可能難以分離。4、要注意記錄好接種名稱及時間。思考題1、分離培養(yǎng)的目的是什么？何謂純培養(yǎng)？分離培養(yǎng)的目的是：主要是在含多種細菌的病料或培養(yǎng)物中挑選出某種細菌。在分離培養(yǎng)時應(yīng)注意：選擇適合于所分離細菌生長的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、氣體條件等。 純培養(yǎng) : 把從一個細胞或一群相同的細胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代 , 稱純培養(yǎng)。2、在挑取固體培養(yǎng)物上的細菌作平板分區(qū)劃線時， 為什么在每區(qū)之間都要將接種環(huán)上剩余的細菌燒掉?在對下一個區(qū)劃線之前灼燒接種環(huán)，可以殺死接種環(huán)上剩余的細菌，這樣，當接種環(huán)再從上個區(qū)拉出一條線的時候，環(huán)上的細菌數(shù)目

5、就少了很多，經(jīng)過這樣的灼燒、劃線，環(huán)上的細菌數(shù)目逐漸減少，最終達到分離出單菌落的目的。3、培養(yǎng)皿培養(yǎng)時為什么要倒置?原因 1 ：防止凝結(jié)在皿蓋上的水蒸氣流到培養(yǎng)基表面導(dǎo)致染菌！2 ：有利于菌種利用培養(yǎng)基營養(yǎng)，加快生長速度！實驗四 細菌的生化實驗1. 解釋所做生化試驗的原理（ 1）細菌生化試驗各種細菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對營養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣， 因而代謝產(chǎn)物或多或少地各有區(qū)別， 可供鑒別細菌之用。 用生化試驗的方法檢測細菌對各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細菌的種屬，稱之為細菌的生化反應(yīng)。（ 2）糖（醇）類發(fā)酵試驗不同的細菌含有發(fā)酵不同糖（醇）的酶，因而發(fā)酵糖（醇）的能力各不相

6、同。其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物亦不相同，如有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。 酸的產(chǎn)生可利用指示劑來判定。 在配制培養(yǎng)基時預(yù)先加入溟甲酚紫 PHS . 2 （黃色）一6 . 8 （紫色） ，當發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來證明。（3）甲基紅試驗（該試驗簡稱 MR試驗） 很多細菌，如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的 pH 降低到 4 . 2 以下，這時若加甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色。因甲基紅指示劑變色范圍是 pH4 . 4 （紅色）一pH6 . 2 （黃色） 。若某些細菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸， 但很快

7、將丙酮酸脫梭， 轉(zhuǎn)化成醇等物， 則培養(yǎng)基的 pH 仍在 6 . 2 以上，故此時加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)黃色。（ 4）大分子物質(zhì)代謝實驗靛基質(zhì)（口引睬）試驗?zāi)承┘毦?，如大腸桿菌，能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)（叫睬） ，靛基質(zhì)與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合， 形成玫瑰色靛基質(zhì) （紅色化合物） 。 硫化氫試驗?zāi)承┘毦芊纸夂虻陌被?（肌氨酸、 半肌氨酸等） ， 產(chǎn)生硫化氫， 硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵。為硫化氫試驗陽性，可借以鑒別細菌。 明膠液化實驗 某些細菌具有膠原酶，使明膠被分解，失去凝固能力，呈現(xiàn)液體狀態(tài)，是為陽性。淀粉水解試驗（在紫外誘變中做，本實驗不做）

8、細菌對大分子的淀粉不能直接利用， 須靠產(chǎn)生的胞外酶 （淀粉酶） 將淀粉水解為小分子糊精或進一步水解為葡萄糖（或麥芽糖） ，再被細菌吸收利用，細菌水解淀粉的過程可通過底物的變化來證明，即用碘測定不再產(chǎn)生藍色。（ 5）有機酸鹽及氨鹽利用試驗檸檬酸鹽利用試驗檸檬酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基， 其中檸檬酸鈉為碳的唯一來源。 而磷酸二氫按是氮的唯一來源。 有的細菌如產(chǎn)氣桿菌， 能利用檸檬酸鈉為碳源， 因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長， 并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽， 使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。 此時培養(yǎng)基中的溟廖香草酚藍指示劑由綠色變?yōu)樯钏{色。 不能利用檸檬酸鹽為碳源的細菌， 在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。2、生化

9、試驗在細菌鑒定中的作用和意義生化實驗在細菌的鑒定中意義很大，因為要想確定一種菌具體屬于哪一種就要通過一系列的生化 實驗幾菌落形態(tài)和顯微觀察來確定，生化實驗是非常重要的一部分.但其實意義 不是很大，一般是根據(jù)伯氏細菌手冊看的，不過現(xiàn)在基本上都是用16S RNA來鑒定，要精確一些。實驗五藥物敏感試驗1、圓紙片藥物敏感試驗操作注意事項藥物不能靠的太近，應(yīng)盡量均勻分布在紙片上。2、試述藥物敏感試驗的意義藥物敏感試驗是為了對臨床標本中分離的菌株選擇何種藥物進行治療有效而進行的一種試驗。常用的有紙片擴散法和微量稀釋法。根據(jù)試驗結(jié)果可以判斷何種藥物對該菌株治療有效（即敏感），何種藥物對該菌株治療 無效（即耐

10、藥）。實驗六血凝及血凝抑制試驗1、病毒凝集紅細胞是不是一種特異的抗原體反應(yīng)？為什么？細胞凝集反應(yīng)，稱為血凝試驗，可用于特異性檢查抗原或抗體。2、HI試驗是不是特異的抗原抗體反應(yīng)？為什么？是，因為HI實驗本身就是一種測定抗原或抗體的技術(shù)，抗原與相應(yīng)抗 體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。這種反應(yīng)即可在機體內(nèi)進行，也可以在機體外進行。抗原抗體反應(yīng)的過程是經(jīng)過一系列的化學(xué)和物理變化，包括抗原抗體特異性結(jié)合和非特異性促凝聚兩個階段， 以及由親水膠體轉(zhuǎn)為疏水膠 體的變化實驗七凝集試驗注意事項1、每次試驗應(yīng)設(shè)標準陽性血清、標準陰性血清和生理鹽水對照。2、抗原保存在28C,用前置室溫3060min,使用前搖勻，如

11、出現(xiàn)搖不散的 凝塊，不得使用。3、被檢血清必須新鮮，無明顯的溶血和腐敗現(xiàn)象。4、平板凝集反應(yīng)溫度最好在 35min內(nèi)記錄結(jié)果，如反應(yīng)溫度偏低，可于 58min內(nèi)判定。5、平板凝集反應(yīng)適用于普查初篩，篩選出的陽性反應(yīng)血清，需做試管凝集試驗，以試管凝集的結(jié)果為被檢血清的最終判定.6、結(jié)果判為可疑時，隔23周后采血重做。陽性畜群，重檢時仍為可疑，可判 為陽性。對同群中既無臨床癥狀又無凝集反應(yīng)陽性者，馬、豬重檢仍為可疑，判 陰性；牛、羊重檢仍為可疑者，可判為陽性，或以補體結(jié)合反應(yīng)核對。思考題1原理：1.平板凝集試驗 顆粒性抗原在體外一定條件下（有電解質(zhì)存在，pH溫度恰當）與相應(yīng)抗體相遇，二者發(fā)生特異反

12、應(yīng)，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物。參加 凝集反應(yīng)的抗原稱為凝集原，而相應(yīng)的抗體稱為凝集素。2.試管凝集試驗試管法直接凝集試驗是將已知的顆粒性抗原懸液定量 地與一系列倍比稀釋的待檢血清等量混合，靜置一定時間后，根據(jù)各管的凝3歡迎下載精品文檔集程度，判斷待檢血清中抗體的效價，常用于半定量檢測。操作方法：加樣 每份血清用4支試管，另取1支為生理鹽水對照，先加生理鹽 水，然后以1ml注射器吸取待檢血清0.2ml加入第1管充分混勻，吸1.5mL 棄之，再吸0.5mL加入第二管，混勻后加入第三管，依次至第 4管，混勻后 棄0.5mL。第5管不加血清，力口 0.5mL生理鹽水、加抗原各管加入以生理鹽水稀釋20倍的布

13、氏桿菌試管抗原0.5mL。感作各管加完后震蕩，將其置37。叵溫多!作用4小時，拿出置室溫18-24小時，觀察結(jié)果。 結(jié)果判定：+: 100%菌體凝集，液體全透明、菌體傘狀沉淀。+ : 75%g體凝集，液體略混濁，菌體大部分呈傘狀沉淀。+: 50%g體凝集，液體不甚透明，管底有明顯的凝集沉淀。+ : 25%g體凝集，液體不顯透明，管底有少量顆粒沉淀。-:陰性，液體不透明，管底無凝集，有時有少量沉淀搖之均勻混濁。以出現(xiàn)“ +”以上凝集的最高血清稀釋倍數(shù)為凝集價。人和大家畜凝集價1: 100以上為陽性，豬、羊、小家畜1: 50以上為陽性；大 家畜1: 50、小家畜1: 25為可疑?？梢傻陌雮€月后重檢

14、，仍可疑，按具體情況 而定（陽性群，判陽性；陰性群，判陰性）。3、影響凝集試驗的因素主要有哪些？1溫度。溫度影響酶的活性2時間。隨著時間的延長細胞聚集程度加大3反應(yīng)底物4細胞類型5反應(yīng)培養(yǎng)板的質(zhì)量6人為因素4、凝集試驗中為什么要設(shè)陽性、陰性血清及抗原對照？某此細菌或病毒當制成細菌或病毒懸液時很不穩(wěn)定，在沒有特異性抗體 存在下，亦可發(fā)生凝集，謂之自凝。某些理化因素亦可引起非特異性凝集， pH降至3.0以下時，即可起抗原懸液的自凝，稱為酸凝集。因此，試驗時 必須設(shè)置陽性血清、陰性血清和抗原等對照是為了排除自凝干擾。實驗八沉淀試驗注意事項1、倒瓊脂板時，要求均勻、平整、薄厚一致，無氣泡。2、瓊擴試驗

15、打孔時不要把瓊脂層與平皿脫離， 孔的邊要圓整光滑，邊緣不要破 裂，要補底處理。3、滴加試劑時不能產(chǎn)生氣泡而影響試驗結(jié)果。4、加樣時每加完一個樣品必須更換滴頭。思考題1什么？可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電介質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀試驗。沉淀反應(yīng)的抗原可以是細 菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液、病毒的可溶性抗原、組織滲出液、多糖、 蛋白質(zhì)、類脂等。測定時將加熱溶化的瓊脂或瓊脂糖澆至玻片上， 等瓊脂凝固后，打多個小孔， 將抗原和抗體分別加入小孔內(nèi)，使抗原和抗體在瓊脂板上相互擴散。當二個 擴散圈相遇，如抗原和抗體呈特異性的結(jié)合且比例適當時，將會形成抗原抗 體復(fù)合物的沉

16、淀，該沉淀可在瓊脂中呈現(xiàn)一條不透明的白色沉淀線。2、瓊脂擴散沉淀試驗結(jié)果為什么有時會出現(xiàn)沉淀帶完全交叉現(xiàn)象？若二孔中抗原不同，當抗血清中分別含有與抗原相應(yīng)的抗體時，則出現(xiàn)沉淀帶完全交叉現(xiàn)象3、瓊脂擴散沉淀試驗在實際中的應(yīng)用價值？本試驗主要用于檢測標本中各種免疫球蛋白和血清中各種補體成分的含量， 敏感性很高。通過該試驗，用特異性抗體鑒定抗原，或反之用已知抗原鑒定 抗體。實驗九：熒光抗體試驗注意事項1、如果懷疑是急性豬瘟,可用活體采扁桃體進行熒光染色。2、待檢的組織病料（扁桃體、腎、淋巴結(jié)等）必須新鮮，如不能及時檢查，應(yīng)冷凍保存。3、制備標本的載玻片越薄越好，應(yīng)無色透明，用前潔凈處理并用綢布擦凈；

17、切片或組織觸片盡可 能薄，太厚不易觀察而影響結(jié)果的判定。4、對含病毒較低的病理組織需先在細胞培養(yǎng)上培養(yǎng)一段時期后再用熒光抗體檢測病毒抗原，可提 高檢出率。5、觀察標本片前熒光顯微鏡一般需預(yù)熱 15分鐘，在暗室內(nèi)進行，熒光顯微鏡 安裝調(diào)試后，最好固 定在一個地方加蓋防護，不再移動。6、標本染色后應(yīng)立即觀察，放置時間過久熒光會逐漸減弱，如不能及時觀察可 將標本放在聚乙烯 塑料袋中于4c保存，可延長熒光保持時間。7、不能長時間在同一個視野下觀察，一般標本在高壓汞燈下照射超過3min即有熒光減弱現(xiàn)象。思考題1、熒光抗體染色的基本原理及實驗結(jié)果的判定?；驹恚簾晒饪贵w技術(shù)就是用不影響抗體活性的熒光素對

18、抗原或抗體進行標記，當標記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后， 就會形成帶有熒光素的復(fù)合 物，在熒光顯微鏡下，由于受高壓汞燈光源激發(fā)的特定波長的光照射，熒光 素就會發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以對相應(yīng)的抗原或抗體分析示蹤。結(jié)果判定：黃綠色閃亮熒光 +黃綠色的鳧熒光 +黃綠色熒光較弱 + +僅有暗淡的熒光十無熒光-2、請舉例說明該技術(shù)在動物疫病診斷中的作用？用豬瘟熒光抗體染色檢測豬瘟病毒，特異性強、準確率高， 實驗十、酶聯(lián)免疫吸附試驗注意事項1 .從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒應(yīng)平衡至室溫后方可使用。2 .未使用的預(yù)包被板條應(yīng)置于封口袋，28c保 存。3 .濃縮液用蒸儲水或超純水稀釋，若發(fā)現(xiàn)有出現(xiàn)結(jié)晶，請放置37c至溶解后使用。7歡迎下載4 .滴加試劑時，應(yīng)先搖勻，并棄去12滴后，垂直滴加。5.使用完畢后，將所有樣品、洗滌液和各種廢物都進行滅活處理。6 . TMB （底物B）不要曝露于強光，避免接觸 氧化劑。7 .待檢樣品較多時，應(yīng)先使用血清稀釋板稀釋完所有要檢測血清，再將