蛋白質(zhì)的定量測(cè)定試驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)蛋白質(zhì)的定量測(cè)定(Folin -酚試劑法)(TitleofExperi metn)實(shí)驗(yàn)日期(DateofExperi ment)XXXX實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(LabNo.)XXXX合作者(Partner)XXXX指導(dǎo)老師(Instructor)XXXX總分(TotalScore)教師簽名(Signature)批改日期(Date)、實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)1.0實(shí)驗(yàn)?zāi)康某醪搅私飧鞣N蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法。掌握Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及熟悉和掌握實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。掌握用excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)管方法求樣品溶液中待測(cè)定物 質(zhì)含量。1.1 實(shí)驗(yàn)原理1.1.1 總體概述Folin-酚試劑法是

2、經(jīng)過(guò)科學(xué)家改進(jìn)的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法，F(xiàn)olin首創(chuàng)這種方法:利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基(酚基)還原酚試劑(磷鴇酸-磷鋁酸)起藍(lán)色反應(yīng)。而后，Lowry對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)， 提高了靈敏度，靈敏度的范圍為：20: 250 g ,故使得實(shí)驗(yàn)的精確度大大提高，但同時(shí) 也存在著干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)等問(wèn)題。 2在堿性浴披中，雙縮月尿(H2NOC NH CONH 2)能和Cu作用，發(fā)生配包反應(yīng)， 形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，即為雙縮月尿反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)與雙縮月尿結(jié)構(gòu)相似，故在堿性溶液中，蛋白質(zhì)的分子中肽鍵2 一_一2. _一_.一能和堿性銅試

3、劑中的Cu作用，生成紫紅色的蛋白質(zhì)-Cu復(fù)合物。對(duì)于蛋白質(zhì)的測(cè)定 來(lái)說(shuō)，這一步是基礎(chǔ)，這也是 Folin-酚法的基礎(chǔ)原理。1.1.3Folin- 酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鋁酸鹽-磷鴇酸鹽易背酚類(lèi)化合物還原 2.而呈現(xiàn)監(jiān)色。酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，故蛋白質(zhì)-Cu復(fù)合物含有的酪氨酸或色氨酸 殘基還原酚試劑中的磷鋁酸和磷鴇酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定的濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。故可以利用上述兩 種反應(yīng)通過(guò)分光光度法測(cè)定待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。本實(shí)驗(yàn)以上述兩個(gè)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，再通過(guò)設(shè)置空白對(duì)照組，標(biāo)準(zhǔn)管中設(shè)置蛋白標(biāo) 準(zhǔn)液的一系列濃度梯度（02mL,

4、 0.4mL, 0.6mL, 0.8mL）通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定吸光 度，從而獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品管通過(guò)測(cè)定的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到較為準(zhǔn)確對(duì)應(yīng) 的含量。1.2實(shí)驗(yàn)材料血清稀釋液（正常人血清稀釋 300倍）200 g/ml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（BSA）;堿性硫酸銅溶液（組成：堿溶液與硫酸銅溶液按50:1混合而成，使用時(shí)該溶液必須新鮮配制，當(dāng)日有效）；Folin-酚試劑（配制過(guò)程較為復(fù)雜）注：此次實(shí)驗(yàn)所用的試劑全部已由老師制備好，所以無(wú)配制過(guò)程，但需知道配制流程，可查閱實(shí)驗(yàn)書(shū)P105oV-1100可見(jiàn)光分光光度計(jì)；恒溫水浴箱；試管6支、試管架；加樣槍、加樣槍架。1.3實(shí)驗(yàn)步驟一溶液混合滴加堿性硫酸銅

5、 * 靜置 10min取6只潔凈的丁管,一利用加樣槍按要出量取神應(yīng)量的溶液,加入Folin-酚試劑水浴10min比色測(cè)定 r /，人同H/比色測(cè)定事繪圖取結(jié)果混合均勻(各試管的需加入的試劑和量見(jiàn)下表J(1)反應(yīng)體系設(shè)置1235牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.60.80樣品液000000.5蒸儲(chǔ)水1.00.80.60.40.20.5(2)雙縮月尿反應(yīng)每I憶分鐘，依次往1號(hào)試管到6號(hào)試管中加入2mL的堿性硫酸銅溶液，搖勻并記錄每支試管的加入硫酸銅時(shí)間， 室溫靜置10min(3) Folin-酚反應(yīng)將靜置時(shí)間達(dá)到10min中的試管中，加入0.20mL的Folin-酚試劑，快速搖勻(一般在2s以?xún)?nèi)

6、)。在400C下水浴加熱10min鐘同樣需計(jì)時(shí)。10min鐘后取出冷卻至室溫。(4)比色測(cè)定轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)旋鈕，調(diào)制500.0nm,按“mod3'鍵切換到T檔， 分別將1-6號(hào)試管中混合液放入比色杯中利用1號(hào)試管為空 白，校置100;調(diào)至A檔，依次測(cè)定2-6試管的吸光度，并讀取數(shù)據(jù)。重復(fù)操作，再讀取數(shù)據(jù)2次，并記錄。數(shù)據(jù)表格見(jiàn)表1(5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線利用測(cè)得的數(shù)據(jù)，繪制以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)的準(zhǔn)備曲線，具體繪制利用excel制作，結(jié)果可見(jiàn)圖2（6）測(cè)樣品蛋白根據(jù)樣品管（6管）的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度，冉乘以稀釋倍數(shù)（300）,得出每毫升未稀釋血

7、 滿含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)質(zhì)含量(mg/ml)。血清蛋白濃度（g/ml）=樣品蛋白質(zhì)濃度x 2 x 300參考：正常人血清蛋白濃度范圍為 6080 g/L 0試劑要求：實(shí)驗(yàn)所需的試劑必須是新鮮配制，不然會(huì)存在被空氣及其他物質(zhì) 氧化還原的情況，干擾實(shí)驗(yàn)的測(cè)定?？刂茣r(shí)間：Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí) 問(wèn)。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟的操作，規(guī)定的時(shí)間是多少就多少。水浴時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)。同時(shí), 在最后從水浴加熱后取出冷卻后，需及時(shí)的進(jìn)行比色測(cè)定。防止混合液中物質(zhì)發(fā)生系列 變化和反應(yīng)。加入Folin-酚試劑后，需要馬上混合搖勻，防止磷鋁酸-磷鴇酸試劑被破壞。

8、干擾物質(zhì)的影響：凡干擾雙縮月尿反應(yīng)的基團(tuán)，均可干擾 Folin-酚反應(yīng)。這些 物質(zhì)在所測(cè)樣品中含量較高時(shí)，則需做校正曲線。若所測(cè)的樣品中含硫酸俊，則需增加 碳酸鈉一氫氧化鈉濃度即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉一氫氧化鈉濃 度1 2倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。繪制曲線要求：作過(guò)原點(diǎn)的直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均 變動(dòng)情況，因此該線不需全部通過(guò)各點(diǎn)，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過(guò)線上的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲 線或直線兩側(cè)。（電腦Excel繪圖，可以不考慮）操作要按照實(shí)驗(yàn)步驟，一步一步來(lái)，防止操作問(wèn)題導(dǎo)致的操作誤差的出現(xiàn)等。二、實(shí)驗(yàn)記錄2.1 實(shí)驗(yàn)條件材料及試劑：本次實(shí)驗(yàn)的試劑和材料均

9、是實(shí)驗(yàn)室配制好的，比例和濃度同實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),故不再贅述。實(shí)驗(yàn)時(shí)間表：總表實(shí)驗(yàn)步驟消耗時(shí)間混合溶液未計(jì)時(shí)滴加溶液靜置10min加Folin-酚試劑、水浴10min室溫冷卻27min等待20min比色測(cè)定6min附表項(xiàng)目時(shí)刻表試管1試管2試管3試管4試管5試管6加硫酸銅8' 42” 098' 43” 208' 44” 298' 45” 458' 46” 558' 47” 55水浴8' 52” 098' 53” 208' 54” 298' 55” 458' 56” 558' 57” 55冷卻等待9'

10、02” 099' 03” 229' 04” 299' 05” 459' 06” 559' 08” 00操作技巧：在這一次的實(shí)驗(yàn)中，關(guān)鍵的要點(diǎn)在于滴加Folin-酚試劑的搖勻，必須快速搖勻，保證反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。振蕩試管時(shí)，振蕩的正確方法是用手腕的力左右擺動(dòng)，使試管中液體混合均勻且不漏出。最后放入到水浴中加熱。在分光比色的時(shí)候，測(cè)量一次后重新凋零，不能繼續(xù)測(cè)量等。操作失誤：全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，就出現(xiàn)了一次失誤，即在試管4加入Folin-酚試劑，充分搖勻，在放入水浴加熱之間，部分液體由于磕碰而濺出。其余操作嚴(yán)格按照要求一步步完成，理論 不存在著失誤。分析:Folin

11、-酚與液體已經(jīng)混合均勻并反應(yīng)，在后面的水浴加熱后，只是影響到了整體 的試管4的反應(yīng)后得到的溶液量，而不影響顏色的變化及最后的比色測(cè)定，故該失誤不 會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生測(cè)定的偏差。2.2 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象在滴加硫酸銅溶液后，搖勻，產(chǎn)生較多的黏性氣泡且附著在液體表面。液體顏色變化 不深。在滴加Folin-酚試劑水浴加熱后，除試管1為淡黃色外，其余試管均成不同的藍(lán)色。具體看下圖：圖一水浴后各試管的情況圖分析:標(biāo)準(zhǔn)液的試管中（2-5）藍(lán)色不斷加深，同實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)液的含量多少正相關(guān)，而 試管6的顏色不深，在1-2試管之間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理初步可以判定的是：該樣品液的蛋 白質(zhì)含量將不會(huì)在60-80g/L之間，而是在0-40g/

12、L。即實(shí)驗(yàn)存在一定的問(wèn)題，詳見(jiàn)結(jié)果 的分析與討論。2.3 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)本次實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)是在500nm的波長(zhǎng)下，各試管混合液的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)下表 1表1500nm波長(zhǎng)吸光度值記錄各管吸光度值A(chǔ)500測(cè)定次數(shù)2345610.3530.5610.7440.9380.17220.3500.5620.7440.9380.17230.3510.5620.7430.9380.172各管平均值A(chǔ)500三、結(jié)果與討論3.1 數(shù)據(jù)處理3.1.1 利用原始數(shù)據(jù)，可得到各管的平均值:2 管:A500= （0.353+0.350+0.351 ） /3=0.3513 ;3管:-500= （0.561+0.562+0.5

13、62 ） /3=0.5617 ;依次彳4到4-6管的吸光度值如下所示：各管吸光度值A(chǔ)500測(cè)定次數(shù) 23456各管平均值 As。0.35130.56170.74370.93800.17203.3分析與討論首先，我們回顧了整個(gè)操作過(guò)程，在整個(gè)過(guò)程中，我們基本都是按照要求操作，并不存 在著明顯的操作問(wèn)題。通過(guò)上面水浴加熱后的圖可以明顯看到，結(jié)果的確應(yīng)該在0-20g/L 之間。同時(shí)我們與和我們一樣使用試劑的組討論后發(fā)現(xiàn)，他們的結(jié)果也是在10幾左右;同時(shí)，很多組測(cè)出的結(jié)果都偏低，故可以初步判定結(jié)果的測(cè)量方式上不存在明顯問(wèn)題。其次，回顧全部過(guò)程的原理，我們猜測(cè)可能存在的造成結(jié)果低的情況為：在室溫冷卻后，

14、實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有空余的分光光度計(jì)，排隊(duì)時(shí)間應(yīng)該是全部小組中最長(zhǎng) 的，基本花去30多分鐘。而這也導(dǎo)致了最后的顯色增強(qiáng)（其具體的顯色原因可能為物 質(zhì)問(wèn)的復(fù)雜反應(yīng)導(dǎo)致）從而使得最后的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率增大，導(dǎo)致測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)的樣品液 蛋白質(zhì)含量的下降。即A<B,如圖所示：吸3光值， 巾M rr、4-i¥i7E 二、莊 i+h分光光度計(jì)的比色杯浩晰不干凈，存.篇hl1般佛1MM“唳果1使樣 ：品液的含量測(cè)定下陋液吸光值 上原本的標(biāo)準(zhǔn)曲一一1開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的試管清洗而不A分B可能存在部分的噪旋，導(dǎo)致顯色反應(yīng)的增強(qiáng)。分光光度計(jì)的幾個(gè)比色杯透明面被碰到， 影響到了液體的吸光度，吸光度的下降， 使得樣品液的測(cè)定值

15、偏低。最后，有可能在以后的時(shí)間里，可以重新做該實(shí)驗(yàn)，從多方面來(lái)驗(yàn)證自己的分析。 多和老師同學(xué)交流，得到較好的結(jié)果3.4復(fù)習(xí)思考題參考資料來(lái)源：牛物化學(xué)與分子牛物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 王曉華,朱文淵主編1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？答：根據(jù)所學(xué)及所查知識(shí)，優(yōu)點(diǎn)總結(jié)如下：測(cè)定蛋白質(zhì)靈敏度高，較為準(zhǔn)確，可檢測(cè)最低蛋白質(zhì)量達(dá)5 g,通常范圍為：20 : 250 g在生物化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。操作雖受時(shí)間限定，但是只需加入兩種試劑，即可起作用，總體上說(shuō)，操作簡(jiǎn)單，原 理清晰易懂。適用性廣，除測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，還可特定的適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？答：對(duì)雙縮月

16、尿反應(yīng)有干擾的離子，同樣干擾 Lowry反應(yīng)，且影響還要大得多。酚類(lèi)、 檸檬酸、硫酸俊、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。原因是：Lowry反應(yīng)的第一步即是雙縮月尿反應(yīng)，即為之基礎(chǔ)。需要盡可能地降低雜質(zhì)的 影響，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高反應(yīng)的效率。濃度較低的尿素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%）、硫酸鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）、硝酸鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為1%）、三氯乙酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%）、乙醇（體積分?jǐn)?shù)為5%）、乙醴（體積分?jǐn)?shù)為5%）、 丙酮（體積分?jǐn)?shù)為0. 5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。 含硫酸俊的溶液，只須加濃碳酸鈉一氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定，若樣品酸度較高， 顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度12倍。3.1.2Excel繪制蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線PPt所示步驟，最終得到如下結(jié)果：圖2標(biāo)