高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離課件

1、高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,APPLICATION OF HSCCC IN SEPARATION OF NATURAL PRODUCTS,Prof. LING-YI KONG,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物化學(xué)研究工作,Column Chromatography,Thin Layer Chromatography,Traditional Research Work of Natural Products Chemistry,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物化學(xué)研究工作，百分之九十左右的時(shí)間在 和一根柱子，一塊板子打交道,Where is the way out

2、,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,高速逆流色譜儀的出現(xiàn)，使得天然產(chǎn)物工作者看到了一絲曙光,Appearance of HSCCC Our hope,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,HSCCC分離天然產(chǎn)物方法學(xué)研究 HSCCC分離香豆素類化學(xué)成分研究 HSCCC分離黃酮類化學(xué)成分研究 HSCCC分離生物堿類化學(xué)成分研究 HSCCC系統(tǒng)分離植物提取物化學(xué)成分研究 HSCCC聯(lián)用分離技術(shù)研究,主要內(nèi)容,Contents,Methodology research of HSCCC in separation of natural products,Research of HSCCC in separa

3、tion of coumarins,Research of HSCCC in separation of flavonoids,Research of HSCCC in separation of alkaloids,Research of HSCCC in systematic separation of plant extract,Research of HSCCC coupled with other instruments,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,研究思路 Research pattern,HPLC分析方法的建立,HSCCC溶劑系統(tǒng)的選擇(分配系數(shù)的測定,HSCCC分離條件優(yōu)化

4、及HSCCC分離純化,化合物純度測定,化合物結(jié)構(gòu)鑒定,樣品制備,重要成分活性研究,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,HSCCC分離天然產(chǎn)物方法學(xué)研究,Methodology research of HSCCC in separation of natural products,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,分離方法建立步驟： 1. 根據(jù)化合物極性、溶解性特點(diǎn)，結(jié)合同類型化合物研究文獻(xiàn)，確定備選溶劑系統(tǒng)。 2. 建立目標(biāo)化合物的TLC、HPLC分析條件。 3. 由所建立的HPLC分析條件準(zhǔn)確測定各目標(biāo)化合物在備選溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)。 4. 由分配系數(shù)估算相應(yīng)保留時(shí)間，分離度及峰寬等色譜參數(shù)。

5、5. 選擇性的選取具有適宜色譜參數(shù)的溶劑系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)試。 6. 優(yōu)化預(yù)試條件，確立最佳條件,Process of method development,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,HSCCC溶劑系統(tǒng)選擇,皂苷、強(qiáng)心苷、黃 酮苷、多酚類等,香豆素、醌類、苯丙 素、生物堿、黃酮等,萜類、甾體、脂肪酸等,Selection of solvent systems,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,HPLC法測定分配系數(shù)的理論基礎(chǔ),Theoretical base of K-value determination by HPLC,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,分配系數(shù)(KD) 與保留因子() 關(guān)系研究

6、,VRVM）/ VM,KD（VS / VM） KD 相比,VR VM KDVS,Relationship of KD and K,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,分配系數(shù)(K) 與分離度(Rs) 關(guān)系研究,Relationship of K and Rs,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,HSCCC峰寬度與分配系數(shù)K的關(guān)系,Relationship of K and peak width,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,峰寬分配系數(shù)關(guān)系圖,保留時(shí)間峰寬分配系數(shù)關(guān)系圖,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,分離度與分配系數(shù)關(guān)系,在螺旋管體積為300ml，相比為1，流速為2ml/min時(shí)， tM=75mi

7、n,K2/K1 1.2：Rs1.0, 兩組分峰重疊小于2% K2/K1 1.31：Rs1.5, 兩組分峰重疊小于1% 兩組分分離程度的判斷依據(jù),高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,Research of HSCCC in separation of coumarins,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,白花前胡 P. praeruptorum Dunn,紫花前胡 P. decursivum (Miq.) Maxim,前胡 Qian-hu,1 化學(xué)成分研究進(jìn)展 以香豆素類化合物為主 白花前胡: 以7,8-二氫吡喃駢香豆素類化合物為主 紫花前胡: 以6,7-二氫吡喃駢香豆素類化合物為主 2 藥理研究進(jìn)展

8、 心血管系統(tǒng)保護(hù)作用 抗血小板凝集作用 抗過敏作用 祛痰作用 抗癌作用,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HPLC色譜圖,色譜柱：SPHERIGEL ODS C18 (250 mm 4.6 mm I.D., 5 m) 流動(dòng)相：乙腈-水 梯度洗脫模式： 0-15 min，乙腈比例由50%線性變?yōu)?0% 15-30 min，由60%線性變?yōu)?0% 35min后，70%乙腈,色譜柱：SPHERIGEL ODS C18 (250 mm 4.6 mm, 5 m) 流動(dòng)相：乙腈-水 梯度洗脫模式： 0-24min，50%乙腈 24-40min，乙腈由50%線性變?yōu)?5,高速逆流

9、色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,分離條件的摸索,針對香豆素類化合物具有較低極性的特點(diǎn)，采用經(jīng)濟(jì)適用環(huán)保的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:47:63)系統(tǒng)，流速12ml/min，分離溫度2035 C ，根據(jù)等度洗脫各峰保留時(shí)間以及分離度決定是否采用梯度模式以及相應(yīng)梯度條件,分離條件,溶劑系統(tǒng),螺旋管的轉(zhuǎn)速,流動(dòng)相的流速,分離溫度,梯度模式,Solvent system,Flow rate,Revolution speed,Column temperature,Gradient mode,Separation condition,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,白花前胡各溶劑系統(tǒng)的K值測定,高速逆流色

10、譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,紫花前胡各溶劑系統(tǒng)的K值測定,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,白花前胡HSCCC溶劑體系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:5:5）以及（5:5:6.5:3.5）較為合適，采用梯度洗脫可使各目標(biāo)化合物均具有較好分離度，適宜的峰寬和保留時(shí)間。而紫花前胡HSCCC溶劑體系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4）效果較為理想,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HSCCC色譜圖,螺旋管轉(zhuǎn)速：900r/min 流動(dòng)相流速：2.0 mL/min 分離溫度：35C 流動(dòng)相梯度模式： 0-150min:石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:5:5） 的下

11、相 150-300min: 由5:5:5:5的下相線性變?yōu)?:5:6.5:3.5的下相 300min后: 流動(dòng)相為5:5: 6.5:3.5的下相,螺旋管轉(zhuǎn)速：900r/min 流動(dòng)相流速：2.0 mL/min 分離溫度：20C 溶劑系統(tǒng)： 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4，v/v），上相為固定相，下相為流動(dòng)相,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,Journal of Chromatography A. 2004, 1057(1-2): 89-94. 2005, 1076(1-2): 127-32,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,Pd-D-V 是首次以純化合物形式分離得到，說明了HSCCC

12、方法的分辨能力很高。 Ostruthin(歐芹素)首次從紫花前胡中分離得到。Ostruthin的含量并不低，但在以前的研究中未從紫花前胡中分離得到，這可能是由于該化合物在常規(guī)分離過程中易發(fā)生變化或易形成死吸附，這也說明了HSCCC方法的優(yōu)越性,小結(jié)： conclusion,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,Research of HSCCC in separation of flavonoids,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,淫羊藿 Ying Yang Huo,朝鮮淫羊藿 Epimedium koreanum Nakai,系小檗科淫羊藿屬植物(Epimedium koreanum Nakai.

13、)的地上全草,主產(chǎn)于我國的遼寧、吉林等地 1 化學(xué)成分研究進(jìn)展 8-異戊烯基取代的黃酮類化合物 2 藥理研究進(jìn)展 心腦血管、免疫系統(tǒng)、骨代謝、生殖系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用, 還有抗腫瘤作用,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,樣品的制備,60C干燥 粉碎至約30目,1000g藥材 10L70%乙醇回流提取2次,浸膏上D101大孔 吸附樹脂柱,水洗至無色，5L70%乙醇洗脫,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干 11.5 g干粉,回收溶劑,Preparation of sample,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,色譜柱：YWG C18 柱(200 mm 4.6 mm I.D., 10 m)； 流動(dòng)相：乙腈-水 0-1

14、2 min: 28%乙腈 12-20 min: 乙腈由28% 線性變?yōu)?5% 30 min:35%乙腈 流動(dòng)相流速：1.0 mL/min,HPLC分析方法建立,HPLC analysis,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,乙酸乙酯-水：Icariside II的純度僅有68.2% 乙酸乙酯-甲醇-水(5:1:5)： 只有icariin 的純度較高，Icariside II 和 epimedokoreanoside I 的純度較低，均不足80% 當(dāng)用乙酸乙酯-甲醇-水 (5:2:5) ：所有的化合物的純度均較差。 氯仿-甲醇-水系統(tǒng),分離條件的摸索,根據(jù)黃酮極性特點(diǎn)，嘗試采用乙酸乙酯-甲醇-水(5

15、:03:5)，氯仿-甲醇-水(4:2.54:2)等體系,適宜比例為4:3.5:2，此時(shí)各目標(biāo)化合物均具有較好分離度，合適的峰寬和保留時(shí)間,Separation condition,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,螺旋管轉(zhuǎn)速：900r/min 流動(dòng)相流速：2.0 mL/min 分離溫度：25C 溶劑系統(tǒng)： 氯仿-甲醇-水 4:3.5:2上相為固定相，下相為流動(dòng)相,HSCCC色譜圖,Journal of Chromatography A. 2005, 1064(1): 53-7,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,Research of HSCCC in separation of alkaloids

16、,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,吳茱萸 Wu Zhu Yu,吳茱萸 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth (E. rutaecarpa,為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.的近成熟果實(shí)，分布陜西、甘肅、安徽、浙江、福建、湖北、湖南、四川、貴州、云南、廣東和廣西等省區(qū)。秋季果實(shí)將近成熟尚未開裂時(shí)采收，除去果柄，曬干或烘干。 1 化學(xué)成分研究進(jìn)展 主含生物堿：吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸因堿、羥基吳茱萸堿、吳茱萸卡品堿。 2 藥理研究進(jìn)展 胃腸道作用，鎮(zhèn)痛，中樞刺激，止血止瀉等,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,色譜柱：SPH

17、ERIGEL ODS C18 (250mm4.6mm I.D., 5um) 流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水 0-22 min: 15:38:47 22-65 min: 45:38:17 流動(dòng)相流速：1.0 mL/min 檢測波長：254nm,HPLC分析方法建立,吳茱萸乙酸乙酯超聲提取物（生物堿部位,HPLC analysis,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,乙酸乙酯-水：生物堿基本分布于固定相中； 乙酸乙酯-甲醇-水： 當(dāng)甲醇含量稍高時(shí)系統(tǒng)不易分層； 環(huán)己烷乙酸乙酯甲醇水：在引入環(huán)己烷后改善了系統(tǒng)分層狀況。其中甲醇比例較小時(shí)，出峰延遲，峰型過寬；甲醇比例較大時(shí)固定相保留不理想,分離條件的摸索,根據(jù)此

18、類生物堿極性特點(diǎn)，嘗試采用乙酸乙酯-水，乙酸乙酯-甲醇-水，環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (5:5:57:5)等體系,確定適宜比例為5:5:7:5,Separation condition,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,HSCCC色譜圖,螺旋管轉(zhuǎn)速：900r/min 流動(dòng)相流速：2.0 mL/min 分離溫度：25C 溶劑系統(tǒng)： 環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 5:5:7:5上相為固定相，下相為流動(dòng)相,Journal of Chromatography A, 1074 (2005) 139144,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,Research of HSCCC in systematic sep

19、aration of plant extract,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,天然藥物的總提取物往往含有從脂溶性到水溶性的具有廣泛 極性的一系列化學(xué)成分，若僅僅對其中主要成分進(jìn)行HSCCC分離 ，不僅無法全面反映與活性相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且以一種溶劑系統(tǒng) 也難以一次性實(shí)現(xiàn)徹底的分離。若采用傳統(tǒng)的系統(tǒng)溶劑分離法，將 總提取物用不同的溶劑逐步劃分為極性從小到大的不同部位，再針 對不同部位，使用不同HSCCC溶劑系統(tǒng)進(jìn)一步分離，不僅可以加 快整體分離速度，而且有利于追蹤主要活性部位，加大有效先導(dǎo)化 合物的發(fā)現(xiàn)幾率，從而使得整個(gè)分離工作的系統(tǒng)性、針對性和完整 性得到了大大增強(qiáng)，最終將促進(jìn)HSCCC技

20、術(shù)成為天然產(chǎn)物化學(xué)研 究中的常規(guī)分離手段，加快天然藥物化學(xué)研究現(xiàn)代化步伐,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,蓼科蓼屬植物何首烏的塊根，原植物廣泛分布于四川、云南、河北、河南、山東、廣東、廣西、福建等省 1 化學(xué)成分 醌類化合物 二苯乙烯苷類化合物 2 藥理作用 心血管系統(tǒng)、抗衰老、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng) 抗腫瘤作用 抗病原微生物作用,何首烏,He Shou Wu,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,500g何首烏藥材,5L 95%乙醇冷浸, 回收乙醇,浸膏(28g,300mL水分散, 乙醚萃取,乙醚部位(8.0g,水溶液,正丁醇萃取,正丁醇部位(7.5g,水部位(10g,D101大孔吸附樹脂

21、, 30%乙醇洗脫,精制正丁醇部位(3.5g,Separated fractions,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,Shimadzu VP-ODS柱 (1504.6 mm I.D., 5 m)。 甲醇-水梯度洗脫，0-60min內(nèi)甲醇由5%線性變?yōu)?00%；1.2mL/min； 254nm,Shimadzu VP-ODS柱 (1504.6 mm I.D., 5 m)。 乙腈-水梯度洗脫，0-45min內(nèi)乙腈由1%線性變?yōu)?00%；0.8mL/min； 254nm,乙醚部位 精制正丁醇部位,HPLC成分分析,HPLC analysis,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,乙醚部位: 主要為化合物I

22、-IV 采用分步洗脫的方法進(jìn)行分離 先用正己烷乙酸乙酯甲醇水（3:7:5:5）體系使I和II分離開 再用9:1:5:5體系的下相作流動(dòng)相，將III洗脫出 IV則留在固定相中，回收固定相得到IV,精制正丁醇部位: 主要為化合物V-IX 用乙酸乙酯甲醇水(50:1:50)體系進(jìn)行分離 先洗脫出V、VI、VII 改變HSCCC儀器螺旋管的旋轉(zhuǎn)方向，同時(shí)將流動(dòng)相變?yōu)?乙酸乙酯甲醇水(50:1:50)上相，將VIII和IX洗脫出,分離策略 separation tactic,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,乙酸乙酯甲醇水(50:1:50): 固定相：上相 流動(dòng)相：下相 300min前正轉(zhuǎn),乙酸乙酯甲醇水

23、(50:1:50): 固定相：下相 流動(dòng)相：上相 300min后正轉(zhuǎn),HSCCC分離：獲得不同極性的一系列化合物,Journal of Chromatography A. 2006, 1115: 64-71,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,Research of HSCCC coupled with other instruments,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,分析儀器 IR、 MS、 TLC、 HPLC-DAD,分離儀器 HSCCCn 、 PHPLC、SFE,檢測儀器 UV-VIS、RID、ELSD,高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離,目前進(jìn)行HSCCC聯(lián)用研究時(shí)需要考慮以下問題： 1連接問題： 目前僅借助通用分流閥來實(shí)現(xiàn)。沒有專門的接口技術(shù)，也沒有實(shí)現(xiàn)接口的模塊化和自動(dòng)化。 2流動(dòng)相問題： HSCCC適用的溶劑范圍十分寬泛, 但與之相連的儀器溶劑范圍并不寬泛。 3分流問題： 對于不同檢測限的設(shè)備，為了達(dá)到不同的目的（分析或者制備），需采用不同的分流比。 4雜質(zhì)的影響：在LC-M S過程中, 復(fù)雜樣品經(jīng)分離后再進(jìn)行質(zhì)譜分析, HPLC的分離情況對M S檢測帶來較大影響。對于HSCCC-M S聯(lián)用分析而言, 同樣須經(jīng)HSCCC分離, 且效果好才能得到滿意的質(zhì)譜信息。 5樣品量：HPLC-FT-IR的聯(lián)用一直受到HPLC流動(dòng)相吸收紅外光譜的困擾。采用HSCC