（分析化學(xué)專業(yè)論文）新型納米金膠和dna酶的傳感技術(shù)對(duì)核酸和蛋白檢測(cè)的應(yīng)用研究.pdf

2 0 10 d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r s c h o o lc o d e ：1 0 2 6 9 s t u d e n t sn u m b e r ：5 1 0 7 0 6 0 6 0 2 8 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y s t u d y o nt h ec o l o r i m e t r i ca n de l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n f o rs n p sa n dt h r o mb i np r o t e i nb a s e do na u n a n o p a r t i c l e s a n dg - q u a d r u p l e x - - b a s e dd n a z y m e s d e p a r t m e n t ： m a j o r ： r e s e a r c hf i e l d ：e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s s u p e r v i s o r ： p r o f e s s o rh ep i n g a n g , f a n gy u z h i s t u d e n t sn a m e ： s h 塾墾i i 叢塾 a p r i l ，2 010 ，s h a n g h a i 華東師范大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 i i i i ii iii ii i ii ii ii i iiii | y 17 4 18 8 9 鄭重聲明：本人呈交的學(xué)位論文新型納米金膠和d n a 酶的傳感技術(shù)對(duì)核酸和蛋白 檢測(cè)的應(yīng)用研究，是在華東師范大學(xué)攻讀硒匆博士( 請(qǐng)勾選) 學(xué)位期間，在導(dǎo)師的指 導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含 其他個(gè)人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均 已在文中作了明確說明并表示謝意。 作者簽名：也塑丕日期：沙f 口年牛月圩日 華東師范大學(xué)學(xué)位論文著作權(quán)使用聲明 新型納米金膠和d n a 酶的傳感技術(shù)對(duì)核酸和蛋白檢測(cè)的應(yīng)用研究系本人在華東 師范大學(xué)攻讀學(xué)位期間在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的碌孟博士( 請(qǐng)勾選) 學(xué)位論文，本論文的 研究成果歸華東師范大學(xué)所有。本人同意華東師范大學(xué)根據(jù)相關(guān)規(guī)定保留和使用此學(xué)位 論文，并向主管部門和相關(guān)機(jī)構(gòu)如國(guó)家圖書館、中信所和“知網(wǎng)”送交學(xué)位論文的印刷 版和電子版；允許學(xué)位論文進(jìn)入華東師范大學(xué)圖書館及數(shù)據(jù)庫(kù)被查閱、借閱；同意學(xué)校 將學(xué)位論文加入全國(guó)博士、碩士學(xué)位論文共建單位數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，將學(xué)位論文的標(biāo)題 和摘要匯編出版，采用影印、縮印或者其它方式合理復(fù)制學(xué)位論文。 本學(xué)位論文屬于( 請(qǐng)勾選) ( ) 1 經(jīng)華東師范大學(xué)相關(guān)部門審查核定的“內(nèi)部”或“涉密學(xué)位論文木， 于年月日解密，解密后適用上述授權(quán)。 ( ) 2 不保密，適用上述授權(quán)。 導(dǎo)師簽名本人簽名邋墨 加l o 年千月辮日 木“涉密”學(xué)位論文應(yīng)是已經(jīng)華東師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)辦公室或保密委員會(huì)審定過的學(xué)位 論文( 需附獲批的華東師范大學(xué)研究生申請(qǐng)學(xué)位論文“涉密”審批表方為有效) ，未經(jīng)上 述部門審定的學(xué)位論文均為公開學(xué)位論文。此聲明欄不填寫的，默認(rèn)為公開學(xué)位論文，均適用 上述授權(quán)) 。 沈碧墨碩士學(xué)位論文答辯委員會(huì)成員名單 姓名職稱單位備注 徐通敏教授華東師范大學(xué)主席 王清江教授華東師范大學(xué)委員 楚清脆副教授華東師范大學(xué)委員 論文摘要 新型納米金膠和d n a 酶的傳感技術(shù)對(duì)核酸和蛋白檢測(cè)的應(yīng)用 研究 論文摘要 隨著人類基因組計(jì)劃( h g p ) 的順利完成和后基因組時(shí)代的到來，基因診斷已經(jīng) 成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)研究的重要領(lǐng)域。脫氧核糖核酸( d n a ) 是生命體內(nèi)的基 因物質(zhì)，具有傳遞遺傳信息等功能，若在結(jié)構(gòu)上稍有變動(dòng)、差錯(cuò)、缺失或增多，就 可能會(huì)導(dǎo)致遺傳性狀的改變或各種疾病的出現(xiàn)，因此對(duì)d n a 的分析檢測(cè)有助于生命 科學(xué)的研究、生命活動(dòng)和信息傳遞規(guī)律的調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)是一類重要的生物標(biāo)志物， 它的分析檢測(cè)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域具有非常重要的意義。如果基因突變?cè)谕?顯引起有功能意義的突變，會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)生改變， 從而影響人類的生命活動(dòng)，導(dǎo)致基因疾病的產(chǎn)生。生命科學(xué)的飛速發(fā)展對(duì)基因和蛋 白的檢測(cè)提出越來越高的要求，開發(fā)出更靈敏，穩(wěn)定和簡(jiǎn)便的生物檢測(cè)技術(shù)是目前 生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)所在。而新興發(fā)展的以w a t s o n c r i c k 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則為基礎(chǔ) 的d n a 生物傳感器為分子生物學(xué)研究提供了全新的基因檢測(cè)技術(shù)，受到生物分析工 作者的高度重視。 分子信標(biāo)的提出正是建立在d n a 堿基互補(bǔ)配原則的基礎(chǔ)上，以其獨(dú)特的莖環(huán) 結(jié)構(gòu)，在選擇性、靈敏度和特異性方面更加優(yōu)于普通的直鏈探針，因此其在基因檢 測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。迄今為止，經(jīng)過研究者們不斷地改進(jìn)，分子信標(biāo)的功能 更足得到了快速的發(fā)展，在p c r 實(shí)時(shí)監(jiān)控、基因突變快速分析、活體細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析 及d n a 與蛋白質(zhì)相互作用研究等各種領(lǐng)域中開辟了新的途徑。 納米技術(shù)的出現(xiàn)為生物傳感器的發(fā)展提供了無窮想象的空間，基于納米金膠的 比色傳感技術(shù)以其方便、快速和肉眼可見的優(yōu)勢(shì)在d n a 生物傳感器中得到了廣泛 的應(yīng)用。納米金膠的良好的生物相容性、簡(jiǎn)單的合成條件、大的比表面積、低廉的 成本以及所具有的特殊的光學(xué)性質(zhì)為比色技術(shù)的發(fā)展注入了強(qiáng)大的生命力，提高了 比色檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性。 隨著核酸研究的深入和體外篩選技術(shù)( s e l e x ) 的建立，核酸適體技術(shù)使抗原抗 體的反應(yīng)發(fā)生了新的革命性變化，在蛋白組學(xué)到來的時(shí)代以其眾多的優(yōu)越性彌補(bǔ)并 逐漸替代抗體在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用。電化學(xué)核酸適體傳感器結(jié)合了電化學(xué)高靈敏度、 論文摘要 輕巧便宜、攜帶方便、耗能少、易微型化等優(yōu)勢(shì)和核酸適體對(duì)蛋白的高結(jié)合力和特 異性更是成為當(dāng)今生物學(xué)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿性課題和方向。 g 四分體結(jié)構(gòu)的d n a 酶也是基于核酸適體配體的思想通過s e l e x 技術(shù)篩選 出來的一種新型的d n a 酶。它是一類卟啉鐵與其適體構(gòu)成的具有g(shù) 四分體結(jié)構(gòu)的 仿辣根過氧化酶的配合物，適體為一段富含g 堿基的寡聚核苷酸序列。自1 9 9 8 年， s e n 小組提出這類d n a 酶以來，它高靈敏的催化性質(zhì)、易于構(gòu)建、易于合成的優(yōu)點(diǎn)， 在比色和電致發(fā)光中得到了極大的發(fā)展。 本文的創(chuàng)新之處就是利用了納米金膠，d n a 酶等簡(jiǎn)單易操作，并且廉價(jià)的的各 種技術(shù)結(jié)合，建立多種檢測(cè)核酸和蛋白的傳感器，發(fā)展了新的基因診斷技術(shù)手段。 論文主要內(nèi)容如下 。 第一章緒論 s e l e x 技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了核酸適體的發(fā)展，這其中也包括g 四分體結(jié)構(gòu)的 d n a 酶發(fā)展。本章首先介紹了d n a 生物傳感器尤其是電化學(xué)核酸適體傳感器、分 子信標(biāo)技術(shù)及納米金膠在比色檢測(cè)中的分類和應(yīng)用，著重介紹了分子信標(biāo)技術(shù)， d n a 酶等的發(fā)展及應(yīng)用，闡明了本論文研究的理論基礎(chǔ)和選題依據(jù)。最后提出本論 文的目的意義及創(chuàng)新之處。 第二章分子信標(biāo)標(biāo)記的納米金膠比色探針對(duì)寡聚核苷酸序列單堿基多態(tài)性的識(shí)別 分子信標(biāo)( m b ) 是一種相比于普通直鏈探針更靈敏地能檢測(cè)單堿基錯(cuò)配的莖環(huán) 結(jié)構(gòu)的探針，因此廣泛被應(yīng)用在各種基因突變的檢測(cè)上。本文介紹了一種利用分子 信標(biāo)高靈敏、高特異性識(shí)別力和納米金凝聚變色的光學(xué)特性，設(shè)計(jì)的新型的識(shí)別單 堿基多態(tài)性的比色檢測(cè)方法。利用納米金膠的自組裝技術(shù)將巰基修飾的分子信標(biāo)探 針固定到金膠表面制得新型納米金膠探針( a u n p s m b ) ，當(dāng)加入不同的目標(biāo)序列( 完 全互補(bǔ)序列或單堿基錯(cuò)配序列) 與之雜交時(shí)，使金膠表面構(gòu)象改變及引起金膠體系 熵焓的差異性：即在適當(dāng)鹽度條件下，導(dǎo)致金膠不同程度的聚集，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單堿 基錯(cuò)配幾率和不同位點(diǎn)的識(shí)別。最后，將該比色傳感體系應(yīng)用在對(duì)p 5 3 基因的檢測(cè) 上，同樣能夠有效區(qū)分野生型和突變型p 5 3 基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)單堿基多態(tài)性的識(shí)別。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果顯示，利用該金膠比色方法，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，對(duì)單堿基錯(cuò)配在混合目 論文摘要 標(biāo)體系中的分辨率能達(dá)到至少5 。 第三章基于g 四分體結(jié)構(gòu)的d n a 酶電化學(xué)核酸適體傳感器信號(hào)擴(kuò)增檢測(cè)凝血酶 本文構(gòu)建了一種結(jié)合核酸適體技術(shù)和d n a 酶的特性，以凝血酶蛋白作為研究 對(duì)象的高效、高靈敏度、特異性識(shí)別蛋白質(zhì)的電化學(xué)催化檢測(cè)的方法。凝血酶的核 酸適體是一段富含g 堿基的寡聚核苷酸序列，它被證實(shí)能與卟啉鐵配位形成一定的 g 四分體結(jié)構(gòu)，當(dāng)其結(jié)合目標(biāo)凝血酶時(shí)，該結(jié)構(gòu)就會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成牢同的d n a 酶 超分子結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出與辣根過氧化酶相似的催化特性，能對(duì)雙氧水進(jìn)行很強(qiáng)的催化 氧化，從而應(yīng)用在電化學(xué)上對(duì)雙氧水的催化氧化來檢測(cè)凝血酶蛋白。該方法通過將 d n a 酶固定在金電極表面，結(jié)合電化學(xué)的高靈敏度，在有雙氧水存在的情況下，得 到催化電流與凝血酶濃度對(duì)數(shù)值在l x l 0 1 0 l 1 0 6m o l l 范圍內(nèi)線性相關(guān)，檢測(cè)限 可以達(dá)到6 x 1 0 - m o l l 相關(guān)系數(shù)為r = 0 9 9 4 ，對(duì)凝血酶蛋白的檢測(cè)限可達(dá)到 6 l 0 0 1 m 。并且該方法對(duì)凝血酶蛋白具有很好的特異性，其它蛋白如牛血清白蛋白、 溶菌酶等均對(duì)凝血酶的檢測(cè)基本無干擾。此新型的生物傳感器制備簡(jiǎn)單，靈敏度和 特異性高，為凝血酶的檢測(cè)提供了一種新的手段。 關(guān)鍵詞：s n p s ，納米金膠，分子信標(biāo)，p 5 3 ，電化學(xué)催化，d n a 酶，核酸適體 m a b s t r a c t s t u d yo nt h ec o l o r i m e t r i ca n d e l e c t r o c h e m i c a lf o rs n p sa n d t h r o m b i nd e t e c t i o nb a s e do na u n a n o p a r t i c l e sa n d g q u a d r u p l e x - - b a s e dd n a z y m e s a b s t r a c t a st h eh u m a ng e n o m ep r o j e c th a su n c o v e r e dt h ef u l ls e q u e n c eo fh u m a ng e n o m e s ， t h ea n a l y s i so ft h ev a r i a t i o n sa m o n gi n d i v i d u a l g e n o m e sh a sa t t r a c t e dc o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i naw i d er a n g eo fa r e a s i n c l u d i n gm o l e c u l a rd i a g n o s t i c s , e n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n g ，a n da n t i b i o t e r r o r i s m p r o t e i ni sat y p eo fi m p o r t a n tb i o m a r k e r s ，w h i c hp l a y sa k e yr o l ei nl i f es c i e n c e s ，m e d i c a ld i a g n o s t i c s m a n yd e t e c t i o nt e c h n i q u e sh a v eb e e n d e v e l o p e dr e l y i n gu p o nt a r g e th y b r i d i z a t i o nw i t hr a d i o a c t i v e ，w h i c hc r e a t ed i s p o s a l p r o b l e m s ，r e q u i r es p e c i a l l yt r a i n e dp e r s o n n e la n dh a v eas h o r t s h e l fl i f e t h e r ei s a c o n s i d e r a b l er e q u i r e m e n tf o rr a p i d ，l o w - c o s t ，a n ds e n s i t i v ed e t e c t i o no fs p e c i f i cd n aa n d p r o t e i nf o rt h ec l i n i c a ld i a g n o s i so fg e n e t i ca n dp a t h o g e n i cd i s e a s e d d n ab i o s e n s o r , a n e wc o n c e p t i o no fg e n o m ed e t e c t i o nb a s e do nw a t s o n c r i c kb a s em a t c hp r i n c i p l e ，i so f g r e a ta d v a n t a g e ss u c ha se a s yh a n d l i n g ，q u i c kd e t e c t i o n ，f a v o r a b l es e l e c t i v i t ya n dn o p o l l u t i o n n o w a d a y s ，i th a sb e c o m eo n eo ft h em o s t i m p o r t a n tm e t h o d si nd n a d e t e c t i o n o n er e c e n td e v e l o p m e n ti sm o l e c u l a rb e a c o n s ( m b s ) t h a ta r eh i g h l ys e l e c t i v ei n t h e i r r e c o g n i t i o n o fo l i g o n u c l e o t i d e s t r a d i t i o n a lm b sa led o u b l ye n d - l a b e l e d o l i g n u c l e o t i d e st h a t e x i s t i ns o l u t i o n sa ss t a b l e s t e m - l o o p s t r u c t u r e sa n du t i l i z e f l u o r e s c e n c eo far e p o r t e rd y ec o m b i n e dw i t hap r o x i m a t eq u e n c h e ra t t a c h e dt o3 e n d m b sa r en o we x t e n s i v e l ye m p l o t e di na r e a ss u c ha s g e n e t i cs c r e e n i n g ，b i o s e n s o r d e v e l o p m e n ta n dt h ed e t e c t i o no fs i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) t oa c h i e v et h ed e s i r e ds i m p l i c i t y , l o w c o s ta n ds e n s i t i v i t y , c o l o r i m e t r i cd e t e c t i o n u s i n gg o l dn a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) h a sb e e na t t r a c t i n gc o n s i d e r a b l ei n t e r e s t s ，b e c a u s e a u n p sa g g r e g a t i o na c c o m p a n i e db yt h es u r f a c ep l a s m o ns h i f tc a nb ec l e a r l yr e c o g n i z e d w i t ht h en a k e de y e t h ee a s eo fs y n t h e s i z i n go fa u n p sa n dt h ep o s s i b i l i t yt oc o u p l eo f a b s t r a c t d i f f e r e n tf u n c t i o n a l i t i e sm a k ea u n p sa sac o n v e n i e n tt o o lf o rt h es e n s i n go fm e t a li o n s ， p r o t e i n sa n do l i g o n u c l e o t i d e s a p t a m e r sa r es y n t h e t i cd n a r n ao l i g o n u c l e o t i d e si s o l a t e df o rt h e i ra b i l i t yt o s e l e c t i v e l yb i n dt ov a r i o u sb i o m o l e c u l e st h r o u g hs e l e x a sa l t e r n a t i v et oa n t i b o d i e s ， a p t a m e r s h a v e m a n ya d v a n t a g e si n c l u d i n gh i g h b i n d i n ga f f i n i t y , c o n v e n i e n t a u t o m a t e d s y n t h e s i s ，e a s e o fl a b e l i n g ，a n dh i g hs t a b i l i t y u pt on o w , m a n ya p t a s e n s o r s h a v eb e e nd e v e l o p e di n c l u d eo p t i c a la n de l e c t r o c h e m i c a la p t a s e n s o r s e l e c t r o c h e m i c a l a p t a s e n s o r sh a v ea t t r a c t e ds u b s t a n t i a la t t e n t i o nb e c a u s eo ft h e i rh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l e i n s t r u m e n t a t i o n ，l o wp r o d u c t i o nc o s t , f a s tr e s p o n s ea n dp o r t a b i l i t yi nt h ed e v e l o p m e n to f 印t a s e n s o r s s i n c et h ef i r s tr e p o r tb ys e na n dh i sc o - w o r k e r si n 1 9 9 8 ，g q u a d r u p l e x - b a s e d d n a z y m e sw h i c hh a v ea l s ob e e ni d e n t i f i e db ys e l e xh a sr e c e i v e dg r e a ta t t e n t i o n t h e f o l d e dg u a n i n e - r i c ho l i g o n u c l e o t i d e st h a ts e r v ea sa l la p t a m e rf o rh e m i nc o u l ds e l f a s s e m b l et of o r mg - q u a d r u p l e xs t r u c t u r e a f t e rb i n d i n gw i t hh e m i n ，t h e r e s u l t i n g s u p r a m o l e c u l a rc o m p l e xm i m i c sh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) a n dc a t a l y z e s t h e h 2 0 2 - m e d i a t e do x i d a t i o no f2 ，2 - a z i n o b i s ( 3 e t h y l b e n z o t h i a z o l i n e ) - 6 一s u l f o m ea c i d ( a b t s ) a n dl u m i n a l t h e s eg - q u a d r u p l e x b a s e dd n a z y m e sh a v es h o w ng r e a tp o t e n t i a la sa n o v e lk i n do fc a t a l y t i cl a b e lf o rt h ed e v e l o p m e n to fv a r i o u sb i o s e n s o r so w i n gt oi t sh i g h c a t a l y t i ca c t i v i t y , e a s ys y n t h e s i sa n dc o n s t r u c t i o n t h eg o a lo fp r e s e n ts t u d yi st od e s i g nn o v e lt e c h n i q u e sw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n d s e l e c t i v i t y t h i sp a p e rh a sc o m b i n e s t h ee x c e l l e n tc h a r a c t e r i s t i c so fa u n p sa n d d n a z y m e st op r o v i d ea l t e r n a t i v ec a n d i d a t e sf o rd n aa n dp r o t e i nd e t e c t i o n t h e d i s s e r t a t i o ni n c l u d e st h r e ep a r t s ： c h a p t e ro n e ：i n t r o d u c t i o n a p t a m e r sa r ea r t i f i c i a lo l i g o n u c l e i ca c i d sw h i c ha r es e l e c t e dt h r o u g hs e l e xt ob i n d s p e c i f i ct a r g e tm o l e c u l e s g u a n i n e - r i c ho l i g o n u c l e o t i d e sa r eo n ek i n do ft h e s ea p t a m e r s w h i c hc a nb i n dh e m i nt of o r mg - q u a d r u p l e x b a s e dd n a z y m e s i nt h eb e g i n n i n go ft h i s v a b s t r a c t d i s s e r t a t i o n ，t h ei m p o r t a n c eo ft h ed n a a n dp r o t e i nd e t e c t i o nw a si n t r o d u c e d ，t o g e t h e r w i t ht h ed e v e l o p m e n to fd n a b i o s e n s o r s e c o n d l y , t h ec o n c e p t sa n da p p l i c a t i o n so f a u n p s b a s e dc o l o r i m e t r i cb i o s e n s i n ge v e n t s ，m o l e c u l a rb e a c o na n de l e c t r o c h e m i c a l a p t a s e n s o r sw e r ed e s c r i b e di nd e t a i lt op r o v i d et h et h e o r e t i c a lp r i n c i p l ef o rt h i sp a p e r a t l a s tt h ep u r p o s ea n di n n o v a t i o no ft h ed i s s e r t a t i o nw e r ep o i n t e do u t c h a p t e rt w o ：l a b e l - f r e em o l e c u l a rb e a c o n - f u n e t i o n a l i z e dg o l dn a n o p a r t i c l e sa s c o l o r i m e t r i cp r o b e sf o r s i n g l e - n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) d e t e c t i o n c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a ll i n e a rd n ap r o b e ，m o l e c u l a rb e a c o ns h o w sh i g h e r s e l e c t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yd u et oi t sc o n f o r m a t i o nv a r i a t i o n sb e t w e e ns t e m 1 0 0 pa n ds t r e t c h e d s t r u c t u r ei nd e t e c t i o no fm u t a t i o n si no l i g o n u c l e o t i d e s w er e p o r t e dan e wc o i o r i m e t r i c s n p sd e t e c t i o nm e t h o db yc o m b i n i n go p t i c a lp r o p e r t i e so fg o l dn a n o p a r t i c l e sa n d m o l e c u l a rb e a c o nw i t ht h eh i g hs p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t y n et h i o l a t e dm o l e c u l a r b e a c o n sw e r ea t t a c h e dt oa u n p sv i aw e l l e s t a b l i s h e ds e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r c h e m i s t r y ap e r f e c t l ym a t c h e dt a r g e ta n dt h es i n g l e - b a s em i s m a t c h e dt a r g e tc a nb e c o m p l e t e l yd i s c r i m i n a t e db yc a u s i n gt h ec h a n g eo fe n t r o p i ca n ds t e r i cc o n f o r m a t i o na t c e r t a i nc o n c e n t r a t i o no fm g c l 2 1 1 1 ec o l o ro ft h eg o l dn a n o p a r t i c l es o l u t i o nc o n t a i n i n g p e r f e c t l ym a t c h e dt a r g e ti sb l u ea n dt h ec o l o ro ft h eg o l dn a n o p a r t i c l es o l u t i o nc o n t a i n i n g s i n g l eb a s em u t a t i o nt a r g e ti sr e d a tl a s t , w ea p p l i e dt h i sm e t h o di np 5 3g e n ed e t e c t i o n t 1 1 er e s u l t si n d i c a t e dt h a ti tw a sp o s s i b l et oa c c u r a t e l yd e t e r m i n es n p sa sl o w 部5 t h e p r o p o s e da p p r o a c hh a sag r e a tp o t e n t i a lf o rr e a l i z i n ga na c c u r a t e ，s e n s i t i v e ，r a p i da n dl o w c o s tm e t h o do fs n p sd e t e c t i o n c h a p t e rt h r e e ：g q u a d r u p l e x - b a s e dd n a z y m e sa p t a s e n s o rf o rt h ea m p l i f i e d e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no ft h r o m b i n an o v e l g - q u a d r u p l e x - - b a s e dd n a z y m e sa p t a s e n s o r f o rt h e a m p l i f i e d e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no ft h r o m b i nh a sb e e nd e s c r i b e d t h ea p t a s e n s o ru t i l i z e da v i a b s t r a c t c o m b i n a t i o no fh e r o i na n dg u a n i n e - - r i c ht h r o m b i n - b i n d i n ga p t a m e r ( t b a ) t of o r mt h e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( r t r p ) - m i m i c k i n gd n a z y m e sw i t hp e r o x i d a s ec a t a l y t i ca c t i v i t y i nt h ep r e s e n c eo ft h r o m b i n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yc o u l db ee x t e n s i v e l yp r o m o t e d , t h e r e b y p r o v i d i n gt h ea m p l i f i e de l e c t r o c h e m i c a lr e a d o u ts i g n a l sf o rd e t e c t i n gt h r o m b i n t h i s a p t a s e n s o re x h i b i t e dh i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yf o rt h r o m b i nd e t e r m i n a t i o n ，w h i c h e n a b l e dt h ea n a l y s i so ft h r o m b i nw i t had e t e c t i o nl i m i to f6 x10 1 1 m o nt h eb a s i so f r e s u l t s ，t h i sm e t h o dw i l ls e r v ea sav e r s a t i l et o o lf o rp r o t e i n sa n do t h e rb i o m o l e c u l e d e t e c t i o n k e yw o r d s ：s n p s ，a un a n o p a t i c l e s ，m o c u l a rb e a c o n , p 5 3 ，e l e c t r o c h e m i c a l c a t a l y s i s ，g - q u a d r u p l e x b a s e dd n a z y m e ，a p t a m e r v 目錄 目錄 第一章緒論l 一納米金膠在d n a 生物傳感器中的應(yīng)用2 二分子信標(biāo)技術(shù)的原理和應(yīng)用”5 1 分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)和原理6 2 分子信標(biāo)的應(yīng)用”7 3 分子信標(biāo)的展望“1 1 三核酸適體生物傳感器及其研究進(jìn)展“l(fā) l 3 1 核酸適體電化學(xué)生物傳感器的原理1 2 3 2 核酸適體電化學(xué)生物傳感器的展望1 6 四d n a 酶在蛋白和d n a 檢測(cè)中的應(yīng)用1 7 4 1g 四分體d n a 酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)1 7 4 2d n a 酶化學(xué)發(fā)光生物傳感器中的應(yīng)用18 4 3d n a 酶在比色檢測(cè)中的應(yīng)用”i8 4 4d n a 酶的展望19 五本論文的目的和意義2 0 1 分子信標(biāo)標(biāo)記的納米金膠比色探針對(duì)寡聚核苷酸序列單堿基多態(tài)性的識(shí) 另u 2 0 2 基于g 四分體結(jié)構(gòu)的d n a 酶電化學(xué)核酸適體傳感器信號(hào)擴(kuò)增檢測(cè)凝血酶 2l 參考文獻(xiàn)21 第二章分子信標(biāo)標(biāo)記的納米金膠比色探針對(duì)寡聚核苷酸序列單堿基多態(tài)性的識(shí)別 2 6 目錄 一 引言2 6 二實(shí)驗(yàn)部分2 8 2 1 試劑與儀器2 8 2 2 實(shí)驗(yàn)方法”3 2 三結(jié)果與討論”3 4 3 1 金膠表面探針密度的估計(jì)3 4 3 2a u n p s m b l 檢測(cè)體系中m g c l 2 度的影響3 5 3 3a u n p s m b l 的選擇性3 7 3 4a u n p s m b l 的s n p s 定量檢測(cè)”3 9 3 5 對(duì)p 5 3 基因的s h i p s 的識(shí)別4 l 四 結(jié)論4 2 參考文獻(xiàn)4 3 第三章基于g 四分體結(jié)構(gòu)的d n a 酶電化學(xué)核酸適體傳感器信號(hào)擴(kuò)增檢測(cè)凝血酶 ”j 4 4 一引言4 4 二實(shí)驗(yàn)部分4 6 2 1 試劑與儀器。4 6 2 2 實(shí)驗(yàn)過程4 7 三結(jié)果與討論4 7 3 1 電化學(xué)交流阻抗和循環(huán)伏安對(duì)傳感器的表征4 8 3 2 傳感器電化學(xué)行為的研究5 0 3 3t b a h e m i n t h r o m b i n 電極的對(duì)h 2 0 2 的電催化還原5 2 3 4 凝血酶的定量檢測(cè)5 3 3 5 傳感器對(duì)凝血酶檢測(cè)的特異性5 4 目錄 四結(jié)論5 5 參考文獻(xiàn)5 6 附錄”5 8 致謝”6 0 i f 1 第一章緒論 第一章緒論 2 0 0 2 年2 月初，由美國(guó)制定并發(fā)起的最龐大的基因組研究計(jì)劃“人類基因組計(jì) 劃”被報(bào)道已完成9 9 的基因序列的測(cè)定。從這時(shí)起，生物學(xué)被重新劃分為前基因 組和后基因組兩部分，并且以揭示基因組的功能及調(diào)控機(jī)制為目標(biāo)的后基因組時(shí)代 宣告正式到來。功能基因組研究成果不僅具有巨大的科學(xué)意義，而且有著十分光明、 廣泛的應(yīng)用前景【1 捌?；?qū)嵸|(zhì)上是d n a 大分子中的各功能片段，不同的基因具有不 同的堿基序列。d n a 分子序列中的微小改變將導(dǎo)致基因突變及多態(tài)性，如一個(gè)或幾 個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入d n a 序列，就會(huì)導(dǎo)致遺傳性狀的改變或各種疾病的出 現(xiàn)【3 4 】，其中單核苷酸多態(tài)性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s s n p s ) 是頻率最高、 信息含量最多的一種變異，占所有多態(tài)性的9 0 以上。由于s n p s 具有數(shù)量多、分布 廣和穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)，跟許多疾病都直接相關(guān)，如1 3 一地中海貧血、乳腺癌等腫瘤 等，是決定人類疾病易感性和藥物反應(yīng)差異的主要因素。因此，s n p s 的靈敏、快速、 方便特異分析檢測(cè)對(duì)于疾病的臨床診斷和治療將起到極其重要的作用。 在人類基因組d n a 中不到1 0 0 0 個(gè)堿基就存在一個(gè)單堿基突變，如果這種突變發(fā) 生在外顯引起有功能意義的突變，會(huì)導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)和 功能的改變，影響人類的生命活動(dòng)，導(dǎo)致基因疾病的產(chǎn)生【5 。7 】。對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能 的研究不僅能夠反應(yīng)基因的突變，而且將直接闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化 機(jī)制，因而蛋白組學(xué)是后基因組科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)是研 究蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究，人體營(yíng)養(yǎng)健康研究，疾病診斷以及藥 物、食品及臨床分析中有重要意義。生命科學(xué)的飛速發(fā)展對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)提出越來 越高的要求，開發(fā)出更靈敏，穩(wěn)定和簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)是目前生命科學(xué)研究的 熱點(diǎn)所在。 材料科學(xué)、生命科學(xué)、電子技術(shù)、生物技術(shù)等許多新技術(shù)的開發(fā)，為發(fā)展高靈 敏度、高特異性的基因和蛋白的分析檢測(cè)方法注入了活力，其中基于w a s t o n c r i c k 模型的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)展起來的各種d n a 生物傳感技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的d n a 凝膠電泳法，d n a 生物傳感器免去了放射性標(biāo)記的危險(xiǎn)性，節(jié)省了電泳操作的繁雜 性，具有操作簡(jiǎn)便、快速靈敏、選擇性好、無污染等特點(diǎn)，并具有分子識(shí)別、分離 純化基因等功能【蹦1