蜂膠和硫酸化多糖的增強免疫和抗病毒活性研究

蜂膠和硫酸化多糖的增強免疫和抗病毒活性研究畜禽傳染病一直是危害畜牧業(yè)發(fā)展的首要問題,尤其是病毒性傳染病,迄今尚無有效的治療方法。采用疫苗接種進行預(yù)防仍是最重要的措施,應(yīng)用免疫佐劑能夠提高疫苗的免疫效果。但是目前國內(nèi)外廣泛使用的油乳類和鋁膠等化學(xué)性免疫增強劑常有局部刺激強、致癌、致畸等副作用。因此,研制高效、低毒的新型免疫增強劑成為亟待解決的問題。蜂膠是一種含有黃酮類、芳香酸類、酚類、氨基酸等多種成分的天然活性物質(zhì),具有增強免疫、抗病毒、抗菌和抗氧化等生物活性；硫酸化多糖是一類天然多糖經(jīng)硫酸化修飾后糖羥基上帶有硫酸根的多糖,比天然多糖具有更多、更強的生物活性。本研究選擇蜂膠和硫酸化多糖為研究對象,分別研究了蜂膠對豬細小病毒滅活苗和硫酸化多糖復(fù)方對雞新城疫疫苗的增強免疫作用和抗病毒活性。試驗分為以下六個部分：試驗Ⅰ、蜂膠對豬細小病毒滅活疫苗佐劑作用的研究為了研究蜂膠對豬細小病毒滅活疫苗的佐劑作用,首先制備蜂膠、鋁膠和油佐劑3種佐劑豬細小病毒(PPV)滅活疫苗,并檢測其安全性。然后比較3種佐劑疫苗對效檢動物豚鼠和家兔的免疫效果。免疫應(yīng)答試驗,分別用豚鼠68只和家兔40只隨機均分為4組,1-3組分別免疫3種佐劑的PPV疫苗,空白對照組注射等量生理鹽水。于免疫后8周內(nèi)每周分別采血測定血清PPV特異性抗體、豚鼠脾臟和家兔外周血淋巴細胞的增殖和IL-2、IL-4的分泌。免疫保護試驗,50只豚鼠隨機均分為5組,3個佐劑組分別免疫3種佐劑的PPV疫苗,攻毒對照組和空白對照組注射等量生理鹽水。于免疫后第42d除空白對照組外用PPV強毒攻毒,攻毒后不同時間點采血測定血清PPV特異性抗體、外周血淋巴細胞的增殖及IL-2和IL-4的分泌,攻毒后28d采集心、肝、脾、肺、腎和性腺用實時熒光定量PCR測定PPV含量。結(jié)果顯示,蜂膠的安全性高于油佐劑和鋁膠佐劑；3種佐劑均能提高豚鼠和家兔對PPV疫苗的免疫應(yīng)答,蜂膠提高血清抗體的效果優(yōu)于鋁膠佐劑、弱于油佐劑,促進淋巴細胞增殖及IL-2和IL-4分泌的效果優(yōu)于油佐劑和鋁膠佐劑；攻毒后,蜂膠提高抗體生成的作用強于鋁膠佐劑,促進淋巴細胞增殖和細胞因子分泌和降低器官中PPV的含量的作用最為顯著。結(jié)果表明,蜂膠對PPV疫苗具有較強的佐劑活性,是一種安全有效的佐劑。試驗Ⅱ、蜂膠對豬細小病毒滅活疫苗免疫效果的影響為了研究蜂膠的佐劑活性,比較了蜂膠、鋁膠和油佐劑3種佐劑的豬細小病毒滅活疫苗對豬的免疫效果。25～30日齡仔豬20頭隨機均分為4組,1-3組分別頸部肌肉注射2mL蜂膠、鋁膠和油佐劑豬細小病毒滅活疫苗,空白對照組注射等量生理鹽水。分別于免疫后第7(D7)、D14、D21、D28、D35和D49耳靜脈采血,用p-微量法檢測血清中豬細小病毒特異性抗體,于D7、D14、D21、D35頸靜脈采血,用ELISA方法測定血清中IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2的含量,于D7、D14、D35頸靜脈采血,用MTT法測定外周血淋巴細胞增殖,同時用ELISA方法檢測淋巴細胞上清液中細胞因子IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量。結(jié)果顯示,蜂膠佐劑組在D7、D14的抗體效價均高于鋁膠佐劑組(P<0.05)和油佐劑組(P>0.05),其余時間點均高于或顯著高于鋁膠佐劑組；在D7～D35,蜂膠佐劑組的IgM、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2的含量均高于或顯著高于鋁膠佐劑組和油佐劑組,IgG1含量顯著高于鋁膠佐劑(P<0.05)；在D7～D35,蜂膠佐劑組的淋巴細胞增殖顯著高于鋁膠佐劑和油佐劑組(P<0.05),IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量多顯著高于鋁膠佐劑和油佐劑組(P<0.05)。這些結(jié)果表明,蜂膠能顯著提高豬細小病毒滅活疫苗的免疫效果,尤其在增強細胞免疫方面優(yōu)于油佐劑和鋁膠佐劑。試驗Ⅲ、蜂膠體外抗PPV的研究為了研究蜂膠的抗病毒作用,測定了蜂膠體外對豬細小病毒感染細胞能力的影響。首先將蜂膠自2000μg·mL-1連續(xù)2倍比稀釋成10個濃度,加到長成單層的豬腎細胞(PK-15)株的培養(yǎng)體系中,用MTT法測定其對PK-15的安全濃度；然后取PPV和安全濃度范圍內(nèi)5個濃度的蜂膠,以3種加藥方式(先加蜂膠后接種病毒、先接種病毒后加蜂膠、蜂膠與病毒混合感作后)加入到PK-15的培養(yǎng)體系中,同法測定PPV感染PK-15能力(細胞A570值)的變化,并用實時熒光定量PCR方法檢測PK-15中PPV的含量。結(jié)果顯示,在3種加藥方式中,蜂膠在31.2-250μg.mL-1范圍內(nèi)的細胞A570值均顯著高于病毒對照組(P<0.05),細胞中的PPV含量均顯著低于病毒對照組(P<0.05),表明蜂膠可以增強PK-15細胞抵抗和清除PPV感染；這種作用與其劑量和給藥方式有相關(guān)性,在安全濃度范圍內(nèi),蜂膠濃度越高則效果越好,以先加蜂膠后接種病毒的作用最好。試驗Ⅳ、硫酸化多糖復(fù)方對雞新城疫疫苗免疫效果的影響在前期研究篩選出增強免疫效果最好的硫酸化多糖、并證明復(fù)方的作用強于單味的基礎(chǔ)上,比較了4個硫酸化多糖復(fù)方對雞新城疫疫苗免疫效果的影響。14日齡蛋公雞270羽隨機分為9組,除空白對照組外均用新城疫IV系疫苗滴鼻點眼免疫,2周后二免。在首次免疫的同時,4個硫酸化多糖復(fù)方組和3個組分(sAPS、sEPS和sLNT)組分別肌肉注射相應(yīng)多糖,無佐劑對照組(NA)和空白對照(BC)組注射等體積生理鹽水。分別于首免后第7(D7)、14(D14)和21(D21)d采血,用p-微量法檢測血清抗體效價,于D14和D21心臟采血,用MTT法測定外周血淋巴細胞增殖,于首免后第23d除BC組外用NDV強毒攻毒,觀察雞的臨床癥狀和死亡情況,連續(xù)觀察14d統(tǒng)計發(fā)病率、死亡率和免疫保護率,于攻毒后第14d采血測定血清抗體效價。結(jié)果顯示,各多糖組在免疫后各時間點的抗體效價均高于、淋巴細胞增殖顯著高于NA組,方1組的抗體效價和淋巴細胞增殖最高、顯著高于NA組(P<0.05)；攻毒后各多糖組的發(fā)病率和死亡率均低于、保護率和抗體效價均高于NA組,方1組的發(fā)病率最低、保護率和抗體效價最高,與NA組的差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明,各多糖均能增強新城疫疫苗的免疫效果,提高攻毒保護率,加速攻毒后血清抗體生成,方1的效果最好。試驗V、硫酸化多糖復(fù)方體外對雞脾臟淋巴細胞的增殖及IL-2和IL-6分泌的影響為了比較硫酸化多糖復(fù)方的增強免疫活性,首先用MTT法測定4個硫酸化多糖復(fù)方對雞脾臟淋巴細胞的安全濃度。然后取安全濃度范圍內(nèi)5個濃度的4個硫酸化多糖復(fù)方及其3個組分多糖(sAPS、sEPS和sLNT)與ConA一起加入到雞脾臟淋巴細胞的培養(yǎng)體系中,用MTT法測定淋巴細胞增殖(細胞A570值)的變化,并用酶聯(lián)免疫吸附法檢測淋巴細胞分泌IL-2和IL-6的含量。結(jié)果顯示,在12.5-3.13μg·mL-1范圍內(nèi),4個硫酸化多糖復(fù)方及sAPS、sEPS的淋巴細胞增殖顯著大于ConA和細胞對照組,所有多糖組的IL-2和IL-6含量顯著高于細胞對照組,方1組的細胞淋巴細胞增殖和IL-2、IL-6含量最高。這些結(jié)果表明,所有復(fù)方及其組分均能協(xié)同ConA顯著刺激淋巴細胞增殖,促進淋巴細胞分泌細胞因子,硫酸化多糖復(fù)方1的效果最好。試驗Ⅵ、硫酸化多糖復(fù)方體外對NDV感染細胞能力的影響為了比較硫酸化多糖復(fù)方的抗病毒作用,首先用MTT法測定4個硫酸化多糖復(fù)方對CEF的安全濃度。然后取安全濃度范圍內(nèi)3濃度的各硫酸化多糖復(fù)