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基于石墨烯dna納米金修飾電極的無(wú)酶葡萄糖生物傳感器
糖尿病是世界上的一種公共疾病。由于缺乏胰島素分泌,這種代謝障礙的糖反應(yīng)為顯著水平或低于正常水平的3.9.62m。這種疾病是造成死亡或殘疾的重要原因之一。因此,診斷和控制糖尿病需要嚴(yán)格監(jiān)測(cè)患者的血糖水平。糖尿病人占世界人口的5%,每天都有數(shù)百萬(wàn)糖尿病人要檢測(cè)他們的血糖濃度,這使葡萄糖成為一種最常見(jiàn)的傳感器檢測(cè)目標(biāo)物。目前葡萄糖傳感器占了生物傳感器市場(chǎng)份額的85%,如此龐大的市場(chǎng)使得葡萄糖傳感器成為開(kāi)發(fā)新傳感策略的主要模型,巨大的經(jīng)濟(jì)前景也激發(fā)了科學(xué)家們對(duì)新型葡萄糖傳感器研發(fā)的熱情,產(chǎn)生了大量的充滿創(chuàng)意的葡萄糖傳感設(shè)計(jì)。在諸多類型的葡萄糖傳感器中,葡萄糖電化學(xué)傳感器一直備受關(guān)注?;谄咸烟欠肿釉谙嚓P(guān)催化活性材料表面的電催化氧化信號(hào)對(duì)葡萄糖進(jìn)行定性及定量檢測(cè)的無(wú)酶葡萄糖傳感器因其具有制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、可重復(fù)利用、價(jià)格低廉且無(wú)需葡萄糖氧化酶的使用等特點(diǎn),其已成為近年來(lái)葡萄糖電化學(xué)傳感器研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。Niu等人利用3D多孔納米鎳修飾電極構(gòu)建了一種具有高靈敏度和高選擇性的新型無(wú)酶葡萄糖傳感器,該葡萄糖傳感器具有0.5μM~4.0mM的超寬線性范圍和0.07μM的低檢測(cè)限并可用于血糖的超靈敏監(jiān)測(cè)。Sun等人利用CuO/石墨烯修飾絲網(wǎng)印刷碳電極結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)構(gòu)建了一種具有超高靈敏度及穩(wěn)定性的新型無(wú)酶葡萄糖傳感器,該葡萄糖傳感器寬線性范圍為0.122μM~0.5mM,其檢測(cè)限可低至34.3nM并可在1h內(nèi)對(duì)葡萄糖進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。石墨烯是一種由碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)的納米新材料。石墨烯作為一種具有二維結(jié)構(gòu)的新型碳基材料,因其具有更大的比表面積及高電子傳導(dǎo)能力、原料易得且價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn),已成為繼碳納米管后新一代的理想電極修飾材料。將石墨烯與金屬納米催化材料聯(lián)合起來(lái)構(gòu)建基于石墨烯-金屬納米復(fù)合材料修飾電極的新型無(wú)酶葡萄糖傳感器將有望進(jìn)一步提高傳感器的各方面性能。本研究結(jié)合金納米顆粒與石墨烯的優(yōu)點(diǎn),首先通過(guò)電解剝離法制得石墨烯/DNA復(fù)合材料,再將納米金顆粒通過(guò)化學(xué)還原法固定在石墨烯/DNA復(fù)合材料表面,最終制得石墨烯/DNA/納米金(Gr/DNA/GNPs)復(fù)合材料。采用滴涂法將Gr/DNA/GNPs修飾在玻碳電極表面,用于葡萄糖的電化學(xué)分析。由于石墨烯表面大量DNA分子的負(fù)載作用,該修飾電極要比基于碳納米管、石墨烯等碳基材料的傳統(tǒng)無(wú)酶葡萄糖傳感器具備更高的納米金負(fù)載量,進(jìn)而表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖分子更強(qiáng)的催化氧化能力。該傳感器可成功用于人血清樣品中葡萄糖濃度的檢測(cè),并同時(shí)具備更高的靈敏度以及更好選擇性和穩(wěn)定性。1實(shí)驗(yàn)部分1.1紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)及超聲波清洗器CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司),三電極系統(tǒng):玻碳電極為工作電極,Ag/AgCl電極為參比電極,鉑絲為對(duì)電極;Cary60紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫儀器有限公司);S-4800掃描電子顯微鏡(日本日立公司);KS-300D超聲波清洗器(寧波科生儀器廠)。鯡魚(yú)精DNA鈉鹽、NaBH4、HAuCl4、葡萄糖均購(gòu)于上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水;所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。1.2gr/dna復(fù)合材料的制備在燒杯中分別加入4mg·mL-1DNA溶液1ml與0.1mol·L-1KNO3溶液400mL制成混合溶液,隨后將兩根高純碳棒碳棒分別插入上述溶液中構(gòu)成兩電極體系。在超聲震蕩下,保持電解電位為4.5V,經(jīng)8h恒電位電解剝離石墨棒,將所得溶液靜置1h自然分層后,上層黑色溶液即為Gr/DNA混合溶液,將Gr/DNA混合溶液離心、水洗三次即得Gr/DNA復(fù)合材料。將1mg·mL-1Gr/DNA溶液與20mmol·L-1HAuCl4溶液1∶1混合,在超聲震蕩下逐滴滴加0.1mol·L-1NaBH4溶液200μL,滴加完畢后保持超聲震蕩30min,將所得Gr/DNA/GNPs溶液離心、水洗三次即得Gr/DNA/GNPs復(fù)合材料。1.3超聲波清洗器的制備將直徑為3mm玻碳電極在拋光布上分別用直徑為0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末拋光至鏡面,然后分別用乙醇和超純水依次在超聲波清洗器中清洗3min,氮?dú)獯蹈伞kS后將一定體積制備好的Gr/DNA/GNPs溶液滴涂在處理好的的玻碳電極表面,自然晾干即得Gr/DNA/GNPs修飾電極。2結(jié)果與討論2.1gr/dna/gnps復(fù)合材料的構(gòu)建圖1為DNA、Gr/DNA和Gr/DNA/GNPs的紫外-可見(jiàn)光譜。由圖可知:DNA在260nm處的吸收峰同樣可在Gr/DNA上觀察到,說(shuō)明高純石墨在含DNA電解液中的電解剝離可使DNA有效地固定在石墨烯之上并形成穩(wěn)定的Gr/DNA復(fù)合材料;而在Gr/DNA/GNPs的紫外可見(jiàn)吸收光譜中,不但可觀察到DNA的吸收峰,還可在520nm處觀察到GNPs的特征吸收峰,說(shuō)明GNPs已有效地吸附于Gr/DNA上形成Gr/DNA/GNPs復(fù)合材料。圖2為Gr/DNA和Gr/DNA/GNPs復(fù)合材料的掃描電鏡圖,圖2A中可觀察到DNA分子均勻分布于多層石墨烯材料的邊緣及表面,圖2B中可見(jiàn)大量平均粒徑為20nm左右的GNPs在Gr/DNA表面均勻分布且無(wú)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。2.2gr/dna/gnps修飾電極的電化學(xué)行為圖3中曲線a~d分別為裸玻碳電極(0.15mol·L-1NaOH)、裸玻碳電極(0.15mol·L-1NaOH+3.0×10-3mol·L-1葡萄糖)、Gr/DNA/GNPs修飾電極(0.15mol·L-1NaOH)、Gr/DNA/GNPs修飾電極(0.15mol·L-1NaOH+3.0×10-3mol·L-1葡萄糖)的循環(huán)伏安曲線。由圖可知,Gr/DNA/GNPs修飾電極在0.15mol·L-1NaOH+3.0×10-3mol·L-1葡萄糖的溶液中可明顯觀察到一個(gè)位于-0.403V處的氧化峰,氧化峰電流為-6.553×10-5A,而在其他曲線中均未觀察到明顯的電化學(xué)信號(hào),這主要是由于Gr/DNA復(fù)合材料上較多帶負(fù)電的磷酸骨架結(jié)合位點(diǎn)吸附了大量在堿性條件下可直接催化葡萄糖氧化的GNPs。因此選用Gr/DNA/GNPs修飾玻碳電極可在堿性條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的無(wú)酶?jìng)鞲小?.3葡萄糖氧化的峰電流葡萄糖氧化電流的強(qiáng)度不僅與其自身的濃度有關(guān),OH-離子的濃度也是一個(gè)十分重要的影響因素。OH-離子的存在能夠使葡萄糖分子更容易吸附于電極表面的Gr/DNA/GNPs之上并降低了葡萄糖氧化的活化能。本實(shí)驗(yàn)在含有1.0×10-2mol·L-1葡萄糖的濃度分別為0.02、0.05、0.10、0.15、0.20和0.25mol·L-1的NaOH溶液中,用循環(huán)伏安法考察了OH-離子的濃度對(duì)葡萄糖氧化峰電流的影響。結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,隨著NaOH濃度即溶液中OH-離子濃度的增加,葡萄糖的氧化峰電流逐漸增大,當(dāng)OH-離子濃度高于0.15mol·L-1時(shí),峰電流隨NaOH濃度增加而降低,因此,本實(shí)驗(yàn)以0.15mol·L-1NaOH溶液作為葡萄糖電化學(xué)檢測(cè)的支持電解質(zhì)。2.4農(nóng)村葡萄糖的保護(hù)循環(huán)伏安掃描的過(guò)程中電位范圍的正確選擇與否會(huì)直接影響到傳感器的檢測(cè)性能。因此,本實(shí)驗(yàn)在含1.0×10-2mol·L-1葡萄糖的0.15mol·L-1NaOH溶液中考察了循環(huán)伏安掃描范圍對(duì)葡萄糖氧化峰電流的影響。如圖5所示,實(shí)驗(yàn)首先固定最高電位為0V,考察了在-1.2~0V、-1.0~0V、-0.9~0V、-0.8~0V、-0.7~0V五個(gè)掃描電位范圍內(nèi)的循環(huán)伏安曲線,結(jié)果表明掃描最低電位為-1.0V時(shí)所得氧化峰電流最大(圖5A);隨后固定最低電位為-1.0V,考察了-1.0~-0.1V、-1.0~0V、-1.0~0.1V、-1.0~0.2V、-1.0~0.4V五個(gè)掃描電位范圍內(nèi)的循環(huán)伏安曲線,結(jié)果表明掃描最高電位為0V時(shí)所得氧化峰電流最大(圖5B)。故循環(huán)伏安的最終的掃描范圍確定為-1.0~0V。2.5gr/dna/gnps修飾量的影響研究了峰電流與Gr/DNA/GNPs修飾量的關(guān)系(圖6),當(dāng)Gr/DNA/GNPs修飾量從1μL增加到5μL時(shí),峰電流隨之增加,Gr/DNA/GNPs修飾量從5μL逐漸增加到12μL時(shí),峰電流呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì),當(dāng)這是因?yàn)榇藭r(shí)電極表面的Gr/DNA/GNPs用量過(guò)多,降低了電極的導(dǎo)電性能,阻礙了葡萄糖與電極之間的電子交換所致。故在本實(shí)驗(yàn)中,Gr/DNA/GNPs的最佳修飾量選為5μL。2.6gr/dna/gnps修飾電極對(duì)葡萄糖的電化學(xué)響應(yīng)圖7考察了在最佳實(shí)驗(yàn)條件下葡萄糖峰電流大小與其濃度的關(guān)系,峰電流與葡萄糖濃度在8.0×10-5~5.0×10-2mol·L-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,其線性回歸方程為Ip,a(μΑ)=3.2+14517.4C(mol·L-1),R2=0.999,以三倍信噪比計(jì)算該修飾電極對(duì)葡萄糖的檢出限為1.2×10-5mol·L-1。實(shí)驗(yàn)還比較了Gr/DNA/GNPs修飾電極與傳統(tǒng)的碳納米管/納米金及石墨烯/納米金修飾電極在相同堿性條件下對(duì)葡萄糖的電化學(xué)響應(yīng)情況(數(shù)據(jù)未列出)。結(jié)果表明,碳納米管/納米金及石墨烯/納米金修飾電極對(duì)葡萄糖電化學(xué)響應(yīng)的線性范圍和檢出限均不如Gr/DNA/GNPs理想,這主要是由于石墨烯表面大量DNA分子的負(fù)載作用顯著提高了對(duì)葡萄糖催化氧化其主要作用的納米金顆粒的負(fù)載量,進(jìn)而使Gr/DNA/GNPs修飾電極表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖分子更強(qiáng)的催化氧化能力。2.7da和hsa的加入對(duì)葡萄糖氧化峰電流的影響在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí),一些葡萄糖共存物可能對(duì)測(cè)定會(huì)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)可能產(chǎn)生干擾的物質(zhì)如尿酸(UA),抗壞血酸(AA)、多巴胺(DA)及人血清白蛋白(HSA)等進(jìn)行了干擾測(cè)試。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,健康人血清中的UA與AA的含量分別是0.02×10-3mol·L-1和0.1×10-3mol·L-1,實(shí)驗(yàn)在含5.0×10-3mol·L-1葡萄糖的0.15mol·L-1NaOH溶液中分別加入0.2×10-3mol·L-1UA和1.0×10-3mol·L-1AA后,葡萄糖氧化峰電流分別增加了2.9%和3.4%,結(jié)果表明UA和AA的加入對(duì)葡萄糖的測(cè)定幾乎不產(chǎn)生影響。這主要是由于修飾電極表面的DNA分子大量帶有負(fù)電荷的磷酸骨架具有排斥同樣為負(fù)電的COO-官能團(tuán)的能力,在堿性條件下,UA和AA均含大量COO-,進(jìn)而被Gr/DNA/GNPs修飾層所排斥,有效阻止了UA和AA向電極表面擴(kuò)散,因而可有效地消除這些電活性物質(zhì)的干擾。實(shí)驗(yàn)在含5.0×10-3mol·L-1葡萄糖的0.15mol·L-1NaOH溶液中分別加入相同濃度的DA和HSA后,葡萄糖氧化峰電流分別降低了2.6%和3.3%,結(jié)果表明DA和HSA的加入對(duì)葡萄糖的測(cè)定同樣無(wú)明顯影響。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Gr/DNA/GNPs修飾電極對(duì)葡萄糖的測(cè)定具有良好的選擇性,可用于人血清樣品的檢測(cè)。2.8修飾電極的穩(wěn)定性在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,用同一支電極對(duì)含有2.0×10-3mol·L-1葡萄糖的溶液平行測(cè)定5次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%。如每次實(shí)驗(yàn)后重新修飾電極,則對(duì)含有2.0×10-3mol·L-1葡萄糖的溶液平行測(cè)定5次的RSD為3.8%。同一支修飾電極在對(duì)濃度為2.0×10-3mol·L-1的葡萄糖溶液分別間隔7、15、30天(其間將修飾電極浸泡在0.15mol·L-1NaOH溶液中,于4℃保存)的測(cè)量結(jié)果分別比原來(lái)的電化學(xué)信號(hào)降低了3.2%、4.8%和8.6%,說(shuō)明該修飾電極用于葡萄糖的測(cè)定具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,其使用壽命至少可達(dá)30天以上。2.9修飾電極的檢測(cè)分別取1.0mL血清樣品(商丘市中心醫(yī)院提供),用0.15mol·L-1的NaOH溶液稀釋至10.0mL,按上述方法測(cè)定,血清的樣品測(cè)得值即為實(shí)驗(yàn)測(cè)得值的10倍;同時(shí)為了進(jìn)一步考察該修飾電極的實(shí)用性,對(duì)相同樣品采用常用市售血糖檢測(cè)儀進(jìn)行了測(cè)試比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,連續(xù)5次測(cè)定,3份樣品的分析結(jié)果RSD均小于3%,樣品加標(biāo)回收率在9
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