低gc含量革蘭氏陽性菌碳分解代謝物阻膦效應的關鍵調控因子

低gc含量革蘭氏陽性菌碳分解代謝物阻膦效應的關鍵調控因子

1ccrpa在非速率碳源治療的機制1942年，jacce檢驗了葡萄糖和半乳液混合碳的環(huán)境。葡萄糖消耗后，開始使用半乳液，導致雙重生長。隨后的研究表明,葡萄糖存在時,其分解代謝物會抑制與其他糖代謝相關的基因表達,這種現(xiàn)象被稱之為碳分解代謝物阻遏(carboncataboliterepression,CCR)效應。E.coli等腸道細菌中介導CCR效應的關鍵調控蛋白為轉錄激活因子CRP(cyclicAMPreceptorprotein),又稱分解代謝基因激活蛋白(catabolitegene-activatorprotein,CAP)。當培養(yǎng)基中不含葡萄糖時,葡萄糖轉運蛋白的EIIA結構域(EIIAGlc)處于磷酸化狀態(tài),能夠激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylatecyclase,AC),催化胞內cAMP的合成,而cAMP在濃度足夠高時可與CRP結合形成復合體,然后激活非速效碳源分解代謝相關基因的轉錄;相反,葡萄糖存在時則會導致EIIAGlc去磷酸化,從而無法啟動非速效碳源的利用。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等低GC含量革蘭氏陽性菌的CCR效應機制與大腸桿菌不相同。在有氧條件下,B.subtilis中檢測不到cAMP,亦未找到CRP類似的蛋白。1991年,Henkin等發(fā)現(xiàn)了B.subtilis中編碼分解代謝物控制蛋白的基因ccpA,將該基因中斷失活后,能夠解除葡萄糖對α-淀粉酶合成基因amyE的抑制作用,從而表明CcpA是B.subtilis中控制CCR效應的關鍵因子。之后的研究者相繼在其他低GC含量革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)了CcpA的存在,如Clostridiumacetobutylicum、Staphylococcusxylosus、Lactobacilluspentosus、Lactococcuslactis、Listeriamonocytogenes、Streptococcusthermophilus、Enterococcusfaecalis、Thermoactinomycessp.E79等。這些研究結果表明,含PTS系統(tǒng)的低GC含量革蘭氏陽性菌大部分可能以CcpA依賴的CCR效應進行碳源次序代謝的調控,且這些CcpA蛋白具有較高的保守性。2ccpa的多效性控制2.1ccrp效應的表達在CcpA調控蛋白被發(fā)現(xiàn)之前,Nicholson等就觀察到,枯草芽孢桿菌B.subtilis的淀粉酶編碼基因amyE啟動子區(qū)存在cre(cataboliterepressionelement)位點,該位點突變后可以解除葡萄糖對amyE的CCR效應,葡萄糖與淀粉即可被同步利用,從而證明cre位點是參與CcpA依賴的CCR效應的重要順式調控元件。隨后的研究表明,除amyE外,許多參與碳源代謝的操縱子內均有cre位點的存在,如gntR(參與葡糖酸代謝)、xylA(參與木糖代謝)、abnA(參與阿拉伯糖代謝)等。1995年,Kim等通過EMSA、footprinting實驗證明了CcpA可以與amyE轉錄起始位點處的cre位點amyO結合,而且這種結合不需要共阻遏物Hpr的協(xié)助;但后續(xù)的相關研究表明,在大多數(shù)情況下CcpA與cre位點的結合需要共阻遏蛋白P-(Ser)-HPr的參與。HPr(histidine-phosphorylprotein)有組氨酸殘基和絲氨酸殘基兩個磷酸化位點,該蛋白的組氨酸殘基在磷酸轉移酶系統(tǒng)(phosphotransferasesystem,PTS)EI(enzymeI)催化下以磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)為底物進行磷酸化,并將磷傳遞給負責葡萄糖轉運和磷酸化的PTS系統(tǒng);HPr蛋白的絲氨酸殘基隨后在Hpr激酶/磷酸酯酶HPrK/P(Hprkinase/phosphoesterase)的催化下被磷酸化,形成P-(Ser)-HPr并與轉錄調控因子CcpA形成復合體,參與CCR效應。HPrK/P的活性受胞內ATP與無機磷酸比例(ATP/Pi)以及葡萄糖代謝產物1,6-二磷酸果糖(FBP)、6-磷酸葡萄糖(G6P)水平的影響。當葡萄糖等速效碳源存在時,胞內高水平的ATP/P與葡萄糖代謝產物激活HPrK/P的激酶活性,將HPr的絲氨酸殘基磷酸化,然后P-(Ser)-HPr與CcpA結合形成復合物,與非速效碳源代謝基因的cre位點結合,抑制其轉錄(圖1)。值得注意的是,B.subtilis中除HPr外,還存在一個HPr的同種異型蛋白Crh(cataboliterepressionHPr-likeprotein),兩者均參與CcpA依賴的CCR效應過程,但前者在這一過程中起主要作用。Hpr缺失后,Crh只能部分地完成Hpr的功能,而Crh缺失后,CCR效應的調控不受影響。而以琥珀酸鹽或檸檬酸鹽為碳源時,編碼Mg2+-檸檬酸鹽轉運蛋白的citM基因特異性地受Crh抑制。Crh目前僅在芽孢桿菌屬中被發(fā)現(xiàn)。2.2ccpa協(xié)助作用下的特定基因當速效碳源存在時,除引起CCR效應外,也有一些基因可以被激活,這種現(xiàn)象稱為碳分解代謝物激活(carboncataboliteactivation,CCA)。CcpA依賴的CCA效應機制與CCR效應類似,即CcpA在共阻遏物P-(Ser)-HPr或P-(Ser)-Crh的協(xié)助下與目的基因的特定序列(如cre序列)結合,激活基因轉錄(圖1)。盡管CcpA對有些基因實施CCA效應時也不需要共阻遏物,但不同點在于,CcpA實施阻遏效應時的cre序列一般在啟動子區(qū)內或在讀碼框內,如amyE、bglP、cccA、dctP、glpF、phoP、acuA等;而CcpA實施激活效應時,其cre序列一般位于啟動子上游,如ackA、pta、ilvB等,也有些受CcpA激活的基因在其啟動子區(qū)未發(fā)現(xiàn)cre序列,如alsSD。2.3ccpa影響碳源代謝的其他機制許多微生物的ccpA基因缺失突變株除解除了CCR效應外,亦表現(xiàn)出其他的表型,如生長受到抑制、產孢減少、產溶劑受影響等,這表明CcpA除參與碳源代謝的CCR/CCA效應外,還可能具有其他的調控功能。2.3.1ccpa對pus操縱子的影響糖酵解是真核細胞及細菌攝入體內的葡萄糖最初經歷的酶促分解過程。已有研究表明,糖酵解途徑的許多關鍵酶基因均受到CcpA的調控。在B.subtilis中,編碼糖酵解過程關鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶的是gap操縱子,而研究表明,gap操縱子的激活依賴于CcpA的存在,但CcpA并不直接與gap操縱子結合,而是通過影響PTS系統(tǒng)及其代謝中間物的方式間接調控gap操縱子。此外,B.subtilis中編碼磷酸甘油酸激酶的pgk操縱子的激活也依賴于CcpA。在L.lactis中,las操縱子編碼參與糖酵解過程的磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶及L-乳酸脫氫酶,該操縱子的轉錄在ccpA缺失突變株中降低了75%。CcpA缺失后,丙酮酸激酶及L-乳酸脫氫酶活性的降低導致代謝產物中乙醇、乙酸的增加,而野生型的發(fā)酵產物主要為乳酸。2.3.2ccpa影響丙酮酸生成l-乳酸的機制在碳源豐富的培養(yǎng)基中,細菌通過糖酵解產生的丙酮酸并不能全部進入三羧酸循環(huán),而是會生成乙酸、乳酸、乙偶姻等代謝產物分泌到胞外,這稱為碳溢流代謝(carbonoverflowmetabolism)。在B.subtilis中的研究發(fā)現(xiàn),即使在高濃度的葡萄糖培養(yǎng)條件下,ccpA突變株也不會發(fā)生碳溢流現(xiàn)象。究其原因是:催化丙酮酸生成乙酸的兩個關鍵酶——磷酸轉移酶和乙酸激酶的編碼基因pta與ackA受到CcpA的正調控;而丙酮酸經乙酰輔酶A生成乙偶姻途徑的關鍵酶乙酰乳酸合酶的編碼基因alsSD到亦受CcpA的正調控;此外,與乙酸、乙偶姻分解代謝相關的acsA、acuABC也受到CcpA的抑制。研究還發(fā)現(xiàn),L.lactis中的CcpA也具有促進丙酮酸生成L-乳酸的功能。這些研究結果表明,在某些細菌中,CcpA參與調控了丙酮酸轉變?yōu)橐宜?、乙偶姻、L-乳酸等可分泌碳源的過程,從而降低了進入TCA循環(huán)的碳流量。2.3.3ccpa影響tca循環(huán)中間產物的表達呼吸作用是生物體細胞把有機物氧化分解并產生能量的化學過程。其中三羧酸循環(huán)(tricarboxylicacidcycle,TCAcycle)是有氧呼吸過程中的關鍵反應過程,是需氧生物體內普遍存在的糖、脂肪和蛋白質在體內徹底氧化的共同代謝途徑。B.subtilis中,CcpA可以直接或間接地抑制參與TCA循環(huán)的檸檬酸合酶編碼基因citZ的表達。與檸檬酸轉運相關的citM-yflN操縱子也是CcpA依賴的CCR效應的直接靶點之一,而對該操縱子起正調控作用的雙組份系統(tǒng)CitS/CitT亦受到CcpA的直接抑制。此外,TCA循環(huán)中間產物的轉運同樣受到CcpA的調控,例如四碳二元酸,如蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸的轉運系統(tǒng)是由dctP基因編碼,該基因以及正調控該基因的雙組份系統(tǒng)dctS/dctR均受到CcpA的抑制。此外,B.subtilis中的resABCDE操縱子、編碼細胞色素c550的cccA基因、編碼細胞色素bd氧化酶的cydABCD操縱子等均參與有氧呼吸過程的電子傳遞,而這些基因的表達均受到CcpA的抑制。2.3.4ccpa影響gltab操縱子的機制微生物能夠以檸檬酸循環(huán)、糖酵解及戊糖磷酸途徑等代謝中間產物為碳骨架合成部分或全部氨基酸。CcpA對谷氨酸的生物合成有促進作用。B.subtilis氨同化過程中,谷氨酸的生物合成是連接碳代謝及氮代謝的紐帶。參與谷氨酸生物合成的谷氨酸合成酶由gltAB操縱子編碼,該操縱子的激活需要糖酵解中間產物的積累,而在ccpA突變株中因無足夠的糖酵解中間產物積累導致gltAB操縱子無法被激活,因而CcpA能夠間接地對gltAB操縱子起到激活作用。CcpA缺失突變株中,gltAB無法激活被認為是葡萄糖-銨鹽培養(yǎng)時菌體生長受抑制的關鍵因素。另外,參與氨基酸降解的谷氨酸脫氫酶的編碼基因rocG亦受到CcpA的CCR效應作用。在ccpA突變株中rocG的CCR效應被解除,導致谷氨酸的合成量減少,從而表現(xiàn)為突變株在葡萄糖-銨鹽培養(yǎng)基上的生長受到抑制。分支氨基酸(branched-chainaminoacids,BCAAs),如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸等的合成則受到CcpA依賴的CCA效應的調控。BCAAs是蛋白質中含量最高的氨基酸,可以形成蛋白質的疏水核心,而且這些氨基酸是異構支鏈脂肪酸和反異構支鏈脂肪酸(芽孢桿菌膜脂脂肪酸的主要種類)生物合成的前體。B.subtilis中負責BCAAs生物合成的關鍵操縱子為ilv-leu操縱子,該操縱子直接受CcpA的激活,其編碼產物參與催化由丙酮酸到氨基酸的生物合成,并且將碳代謝與氨基酸合成偶聯(lián)起來。2.3.5ccpa影響生物被膜的表達CcpA除了廣泛地參與碳、氮代謝的調控外,在某些微生物中還參與一些特殊的生理過程,如產孢、產溶劑、毒性基因的表達等。在重要的產溶劑梭菌C.acetobutylicumATCC824中,ccpA中斷后,在不調控pH的情況下,突變株在發(fā)酵培養(yǎng)基中出現(xiàn)酸累積,從而無法正常產生溶劑。這表明CcpA直接或間接地參與了該菌株產酸產溶劑過程的調控。在一些致病菌如釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)中,CcpA直接激活毒性基因的表達。此外,在胚芽乳桿菌(Lactobacillusplantarum)中,CcpA參與調控dnaK(編碼熱休克蛋白)、groESL操縱子(編碼分子伴侶)的激活,ccpA突變菌株在熱激后的存活率比野生型菌株明顯降低;在B.subtilis及S.aureusSA113中,CcpA通過調控cidA、icaA、citB、citZ等基因的表達促進生物被膜(biofilm)的形成;在C.perfringens中,CcpA通過抑制pilT、pilD基因的轉錄進而負調控TFP依賴的滑移運動,且該菌的充分產孢和生物被膜的充分形成亦依賴于CcpA,但具體機制尚不清楚。3ccpa結構與功能的研究3.1ccpa結構及連接域分析CcpA屬于LacI-GalR轉錄因子家族,其N末端為DNA結合結構域(DNAbindingdomain,DBD),C末端結構域又稱核心結構域(coredomain),參與同源二聚化及共阻遏物的結合。在巨大芽孢桿菌B.megaterium中,CcpA的N末端DNA結合結構域由60個氨基酸殘基組成,包含兩個DNA結合元件:由3個α螺旋(helix1~3)形成的螺旋-轉角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)結構,結合DNA雙螺旋的大溝;由helix4形成鉸鏈螺旋(hingehelix),結合DNA雙螺旋小溝。C末端的核心結構域由第61~332個氨基酸殘基組成,可分為N亞結構域(Nsubdomain)及C亞結構域(Csubdomain)。N亞結構域含4個α螺旋(I~III,IX),包圍著6股平行β折疊片(A~E,J),參與同共阻遏物的結合。C亞結構域含5個α螺旋(IV~VIII),包圍著5個β折疊股(F~I,K)。兩個亞結構域間由βE-αIV、βI-αIX、βJ-βK形成3個連接,使得兩個亞基間可以旋轉(圖2)。B.megaterium的CcpA與P-(Ser)-HPr、P-(Ser)-Crh等共阻遏物及cre序列結合的復合體結構已經得到解析。但由于CcpA的N末端DBD與C末端核心結構域之間的連接很不穩(wěn)定,因而完整的CcpA單晶很難獲得。B.megaterium、B.subtilis、L.lactis中斷開的CcpAC末端結構域及N末端DNA結合結構域的結構也已分別得到解析。3.2ccpa影響cre位點的機制一般情況下,CcpA需要結合共調節(jié)物P-(Ser)-HPr發(fā)生變構才能與cre序列結合。通過比較CcpA-P-(Ser)-HPr-cre復合體中CcpA的結構和脫輔基的CcpA(apoCcpA)結構,可以發(fā)現(xiàn),結合了P-(Ser)-HPr后,CcpA的C亞結構域幾乎不受影響,但N亞結構域發(fā)生了3~8°的旋轉,從而由“關”的狀態(tài)變?yōu)椤伴_”的狀態(tài)(圖3C)。CcpA與P-(Ser)-HPr的相互作用主要是通過CcpA二聚體中單體1N亞結構域的α螺旋I、IX及單體2N亞結構域α螺旋I、II來實現(xiàn)的,其中CcpA的Tyr295、Ala299、Val300、Leu304等氨基酸殘基可以與P-(Ser)-HPr的Ile47、Met48、Met51等氨基酸殘基形成緊密的界面(圖3)。CcpA與P-(Ser)-HPr結合后,后者的Ser46-P可與CcpA中Arg303作用,使Arg303旋轉并隨之造成Tyr89位置的改變,進一步導致Tyr91和Thr306間氫鍵的斷裂,Tyr91將Thr61排出,使N末端DBD的HTH結構發(fā)生約180°旋轉,改變兩個CcpA單體鉸鏈螺旋的排列,從而使CcpA與cre位點結合CcpA位于N亞結構域和N末端DBD之間的Thr61的位置變化是這種“開關”調控的關鍵。芽孢桿菌中HPr的同種異型蛋白Crh參與CcpA變構調節(jié)作用的機制與HPr類似,但HPr與CcpA的結合能力比Crh高10倍左右。6-磷酸-葡萄糖、1,6-二磷酸-果糖同CcpA的結合可以對其結構進行微調,增強CcpA-P-(Ser)-HPr與cre的結合。作為多效調控因子,CcpA可以同很多基因的cre位點結合,這些cre位點具有一定的保守性,同時也有一定的差異。CcpA如何同這些差異的cre位點結合,在抑制一些基因表達的同時又能激活一些基因的表達呢?Schumacher等分別以受CcpA激活、抑制及隨機的cre位點與CcpA共結晶,通過對晶體結構的分析,發(fā)現(xiàn)CcpA-P-(Ser)-HPr復合體與上述三個cre位點結合的親和性是相近的。在與不同的cre位點結合時,CcpA的結構,尤其是DNA結合結構域會發(fā)生不同角度的彎曲。在這個過程中,CcpADNA結合結構域的Arg22、Leu55這兩個保守的氨基酸殘基識別cre序列的保守區(qū),而一些非極性氨基酸,如I5、A18等,可以加強與cre序列的結合過程,從而使CcpA-P-(Ser)-HPr復合體與不同cre位點結合的親和性相近。由此,再根據之前研究人員的工作,我們可以得出結論,CcpA行使阻遏或激活效應主要是由cre位點的位置決定的,行使阻遏效應時的cre位點一般在啟動子區(qū)內或在讀碼框內,如amyE、bglP、cccA、dctP、glpF、phoP、acuA等;而CcpA行使激活效應時,其cre位點一般位于啟動子上游。3.3ccpa影響cre位點及ccrpa回復突變的機制由于CcpA具有多效性調控功能,將其敲除后會影響許多生理代謝過程,因此有必要研究其結構與功能的關系,而對CcpA進行點突變及隨機突變是了解其功能域和活性位點的重要手段之一。在B.megaterium中,CcpA發(fā)生T4S、7H、N49S單點突變后,可解除對xylA基因的抑制,且保持菌體的正常生長。這三個氨基酸殘基均位于CcpAN末端DBD結構域,Thr4是HTH結構的第一個氨基酸,Arg47位于N末端DBD與C末端核心結構域的連接處,Asn49參與形成鉸鏈α螺旋與DNA小溝結合。這三個位點突變成相似氨基酸后,可能僅影響CcpA與部分cre位點的結合(如xylA上游的cre位點),但不影響與生長相關的基因的激活(如分支氨基酸的合成),