鹽橋?qū)?xì)菌類蛋白耐熱的影響

鹽橋?qū)?xì)菌類蛋白耐熱的影響

離子去除機(jī)制（iun）或salt橋是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一個(gè)靜電作用。長期以來，它被認(rèn)為是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要因素，在蛋白質(zhì)的折疊、結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用。然而,鹽橋?qū)τ诘鞍踪|(zhì)耐熱性的貢獻(xiàn)問題一直是人們討論的焦點(diǎn)。MAVES等進(jìn)行組合突變試驗(yàn)研究了來自耐熱菌Sulfolobussolfataricus的蛋白質(zhì)CYP-119的耐熱性。通過一系列的定點(diǎn)突變試驗(yàn)并與野生型CYP-119進(jìn)行比較,在進(jìn)行的13個(gè)定點(diǎn)突變中,大多數(shù)突變改變了分子表面的帶電荷氨基酸殘基,而這些氨基酸參與了鹽橋的形成。他們發(fā)現(xiàn)突變后的蛋白質(zhì)比野生型蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差,認(rèn)為鹽橋?qū)Φ鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性沒有提高作用。STROP等研究了Pyrococcusfuriosus紅素氧化蛋白(PFRD-XC4)中2個(gè)表面鹽橋?qū)Ψ€(wěn)定性的貢獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)一個(gè)鹽橋有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用,而另一個(gè)鹽橋?qū)Φ鞍踪|(zhì)耐熱性有負(fù)作用。另外的觀點(diǎn)認(rèn)為鹽橋是耐熱蛋白質(zhì)的主要穩(wěn)定因素。MERZ等對Thermotogamaritima中的吲哚甘油磷酸合成酶(tIGPS)的2個(gè)鹽橋進(jìn)行了突變。一個(gè)鹽橋連接著N端和蛋白質(zhì)內(nèi)核,另一個(gè)鹽橋存在于螺旋結(jié)構(gòu)之間,2種鹽橋都能提高蛋白質(zhì)耐熱性。KAWAMURA等破壞了Bacillusstearothermophilis的DNA結(jié)合蛋白HU中的Glu34-Lys38鹽橋,該蛋白質(zhì)的耐熱性降低,說明鹽橋?qū)@種蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用。由此可知,鹽橋?qū)Φ鞍踪|(zhì)耐熱性的影響作用不能一概而論,應(yīng)該對鹽橋進(jìn)行詳細(xì)分類,研究鹽橋數(shù)目和類型對蛋白質(zhì)耐熱性的作用。本文以NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)COG(ClusterofOrthologousGroupsofProteins)數(shù)據(jù)庫中具有全基因組的單細(xì)胞微生物中三維結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)為研究對象,細(xì)致地分析了古細(xì)菌和細(xì)菌的耐熱性與鹽橋的關(guān)系,并闡明了鹽橋?qū)偶?xì)菌和細(xì)菌耐熱性作用的異同點(diǎn)。1材料和方法1.1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)在NCBICOG數(shù)據(jù)庫中共有66個(gè)具有全基因組的單細(xì)胞微生物,然而并不是所有微生物的每個(gè)蛋白質(zhì)序列都對應(yīng)著三維結(jié)構(gòu)。已知蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的微生物有36種,挑選的微生物及其蛋白質(zhì)所對應(yīng)的PDB(ProteinDataBank)號參見文獻(xiàn),共有7種超高溫古細(xì)菌(127個(gè)具有三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì));2種高溫古細(xì)菌(34個(gè)具有三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì));1種超高溫細(xì)菌(120個(gè)具有三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì));25種常溫細(xì)菌(258個(gè)具有三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì))。1.2鹽橋網(wǎng)絡(luò)的模擬帶正電荷的氨基酸為Lys、Arg和His而帶負(fù)電荷的氨基酸為Asp和Glu。當(dāng)帶相反電荷的2個(gè)原子之間的距離小于4A。4A。時(shí),它們之間可能形成鹽橋。而當(dāng)3個(gè)以上帶電殘基側(cè)鏈基團(tuán)聚集一起時(shí),被稱為鹽橋網(wǎng)絡(luò)或離子對網(wǎng)絡(luò)。首先通過ccp4-5.0.2(Linux)計(jì)算蛋白質(zhì)中每個(gè)原子與其他原子之間的相互作用;再用Perl編程分解出原子作用距離小于4A。4A。且為帶電荷氨基酸的原子,根據(jù)帶電荷氨基酸與其他帶相反電荷氨基酸形成的鹽橋數(shù)目大于1時(shí)按1個(gè)計(jì)算的原則來統(tǒng)計(jì)鹽橋數(shù)目。本文主要統(tǒng)計(jì)了鹽橋總含量、鹽橋網(wǎng)絡(luò)占鹽橋總數(shù)的比例、鹽橋中帶各種電荷氨基酸的比例、總帶電荷氨基酸形成鹽橋的比例以及各帶電荷氨基酸形成鹽橋的比例(這里的鹽橋數(shù)目為某類蛋白質(zhì)中每100個(gè)氨基酸殘基所含有的鹽橋數(shù)目)。2結(jié)果與討論2.1鹽橋的形成和鹽橋、高溫和高溫蛋白質(zhì)的關(guān)系表1列出了所有與鹽橋相關(guān)的參數(shù)值及其隨蛋白質(zhì)耐熱性的變化趨勢。從表1可知:對于古細(xì)菌類微生物,超高溫蛋白質(zhì)中的總鹽橋含量和鹽橋網(wǎng)絡(luò)的比例都高于高溫蛋白質(zhì),但不是顯著性變化。從鹽橋中各帶電荷氨基酸的比例來看,Arg的比例顯著降低,Lys的比例顯著升高,His的比例沒有顯著變化,Glu和Asp的比例也沒有顯著變化但變化比較大,1個(gè)升高,1個(gè)降低。這表明超高溫蛋白質(zhì)和高溫蛋白質(zhì)在形成鹽橋時(shí)所使用的帶電荷氨基酸具有傾向性。將所有的帶電荷氨基酸看作一個(gè)整體,分析蛋白質(zhì)鏈中的帶電荷氨基酸有多少參與鹽橋的形成(并非所有的帶電荷氨基酸都可以形成鹽橋),發(fā)現(xiàn)帶電荷氨基酸形成鹽橋的比例沒有顯著變化。而對于每個(gè)帶電荷氨基酸形成鹽橋的比例,Asp形成鹽橋的比例有顯著提高,因此在形成鹽橋方面,超高溫古細(xì)菌對Asp的利用率比較高。對于細(xì)菌類微生物,總鹽橋含量和鹽橋網(wǎng)絡(luò)的比例都有顯著的升高,表明鹽橋是耐熱性的主要貢獻(xiàn)者。從各帶電荷氨基酸在鹽橋中的比例看,Lys和Glu的比例顯著升高,His和Asp的比例顯著降低。因此在形成鹽橋時(shí),耐熱蛋白質(zhì)盡量采用帶正電荷的Lys和帶負(fù)電荷的Glu,而常溫蛋白質(zhì)盡量采用帶正電荷的His和帶負(fù)電荷的Asp。帶電荷氨基酸形成鹽橋的比例也是耐熱蛋白質(zhì)顯著升高,說明即使耐熱蛋白質(zhì)和常溫蛋白質(zhì)含有等量的帶電荷氨基酸,由于耐熱蛋白質(zhì)對帶電荷氨基酸的利用率高,其穩(wěn)定性也會提高。對于每個(gè)帶電荷氨基酸形成鹽橋的比例,Arg、Lys、Glu、Asp形成鹽橋的比例都有顯著提高。無論古細(xì)菌還是細(xì)菌類蛋白質(zhì),總鹽橋含量和鹽橋網(wǎng)絡(luò)的比例都隨耐熱性的增加而增加,說明鹽橋的確是蛋白質(zhì)耐熱性的最直接因素。大量文獻(xiàn)也表明鹽橋和鹽橋網(wǎng)絡(luò)是蛋白質(zhì)穩(wěn)定的主要因素。2.2鹽橋網(wǎng)絡(luò)對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響圖1到圖4分別表示了各類蛋白質(zhì)中鹽橋和鹽橋網(wǎng)絡(luò)的分布以及鹽橋和鹽橋網(wǎng)絡(luò)與蛋白質(zhì)耐熱性的關(guān)系。圖1表明:超高溫的古細(xì)菌類蛋白質(zhì)和細(xì)菌類蛋白質(zhì)以及常溫的細(xì)菌類蛋白質(zhì)的鹽橋個(gè)數(shù)在數(shù)據(jù)集中都是正態(tài)分布(曲線所示),而高溫古細(xì)菌類蛋白質(zhì)的鹽橋個(gè)數(shù)不符合正態(tài)分布,有的蛋白質(zhì)的鹽橋數(shù)目明顯很大,而鹽橋數(shù)在30～60之間的蛋白質(zhì)幾乎沒有,這可能是高溫古細(xì)菌蛋白質(zhì)數(shù)量較少造成的。從最高分布來看,超高溫古細(xì)菌類蛋白質(zhì)和超高溫細(xì)菌類蛋白質(zhì)集中在20～25個(gè)鹽橋個(gè)數(shù),高溫古細(xì)菌類蛋白質(zhì)和常溫細(xì)菌類蛋白質(zhì)集中在15～20個(gè)鹽橋個(gè)數(shù)。從統(tǒng)計(jì)意義上來說,無論是古細(xì)菌還是細(xì)菌類蛋白質(zhì),鹽橋個(gè)數(shù)都是與蛋白質(zhì)耐熱性成正相關(guān)的關(guān)系。圖2表明無論是古細(xì)菌類蛋白質(zhì)還是細(xì)菌類蛋白質(zhì),隨著耐熱性的提高,連接鹽橋總含量平均值的直線是上升的趨勢,因此鹽橋總含量與蛋白質(zhì)耐熱性之間是正相關(guān)的關(guān)系。圖3表明:鹽橋網(wǎng)絡(luò)在各類蛋白質(zhì)中都不符合正態(tài)分布。從最高分布來看,超高溫古細(xì)菌類蛋白質(zhì)和超高溫細(xì)菌類蛋白質(zhì)都集中在50～60個(gè)鹽橋網(wǎng)絡(luò),而高溫古細(xì)菌類蛋白質(zhì)集中在40～50個(gè)鹽橋網(wǎng)絡(luò),常溫細(xì)菌類蛋白質(zhì)集中在40～60。鹽橋網(wǎng)絡(luò)分布不同造成了蛋白質(zhì)耐熱性的差異。圖4表明:無論是古細(xì)菌類蛋白質(zhì)還是細(xì)菌類蛋白質(zhì),隨著耐熱性的提高,連接鹽橋網(wǎng)絡(luò)平均值的直線是上升的趨勢,因此鹽橋網(wǎng)絡(luò)與蛋白質(zhì)耐熱性之間是正相關(guān)的關(guān)系。3鹽橋保水性和堿土壤金屬對鹽橋熱穩(wěn)定性的影響綜合上述結(jié)果可知:鹽橋?qū)Φ鞍踪|(zhì)耐熱的影響作用是復(fù)雜的,它對古細(xì)菌類蛋白質(zhì)和細(xì)菌類蛋白質(zhì)耐熱性的影