植物組培試驗方案 植物脫毒技術(shù)

模塊三崗位提升

項目六組培試驗方案設(shè)計任務(wù)12植物離體快繁技術(shù)任務(wù)13組培試驗設(shè)計與分析任務(wù)14植物脫毒技術(shù)任務(wù)15組培工廠化生產(chǎn)【知識點】

掌握熱處理、微莖尖、以及莖尖培養(yǎng)

結(jié)合熱處理脫除病毒的原理及方法

脫病毒苗木的獲得

脫病毒植株的檢測等【技能點】會莖尖培養(yǎng)。素質(zhì)要求：培養(yǎng)學(xué)生無菌意識、創(chuàng)新意識、團隊合作意識和生態(tài)環(huán)保意識；具有任務(wù)執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、實事求是的工作態(tài)度。任務(wù)14植物脫毒技術(shù)一、病毒特性及危害1.病毒特性及其侵染癥狀病毒無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)外殼保衛(wèi)著核酸。核酸僅為DNA或RNA。寄生于活細(xì)胞，不能獨立代謝，缺乏核糖體，必須依賴寄主合成蛋白質(zhì)。其核酸能利用寄主細(xì)胞進(jìn)行自我復(fù)制。具有侵染力，其核酸能從一種寄主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他寄主細(xì)胞。2.病毒轉(zhuǎn)運方式短距離轉(zhuǎn)運：胞間連絲。速度慢，普通煙草花葉病毒運轉(zhuǎn)速度為6-13μm/小時。長距離轉(zhuǎn)運：植物韌皮部的疏導(dǎo)組織（篩管和管胞），木質(zhì)部的導(dǎo)管和管胞不參與。隨營養(yǎng)輸送進(jìn)行轉(zhuǎn)移，速度快。一旦病毒進(jìn)入韌皮部，轉(zhuǎn)運速度突然增快。水稻條紋葉枯病毒運轉(zhuǎn)速度為25cm/h。無性繁殖植物：受一種或多種病原菌侵染。如草莓可感染62種病毒和類菌質(zhì)體，造成產(chǎn)量降低，品質(zhì)退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)10-18%?；ɑ懿《疚：Γ河^賞價值下降，如花少而小，產(chǎn)生畸形、變色等。3.植物病毒病的危害柑橘衰退?。涸鴼绨臀鞯母涕伲グ_洲600萬株甜橙死亡（占總數(shù)的75%），至今仍威脅著世界上的柑橘產(chǎn)業(yè)。棗瘋?。簬缀鯕缑茉频慕鸾z小棗。馬鈴薯：病毒侵染（有10多種）后，塊莖小，產(chǎn)量下降，由8000-10000斤降到1000-2000斤。4.解決植物病毒病的對策離體培育無毒苗已成為農(nóng)作物、園林植物、經(jīng)濟作物的優(yōu)良品種繁育、生產(chǎn)中的一個重要環(huán)節(jié)。不少國家已將其納入常規(guī)良種繁育的一個重要程序，建立無病毒（virus-freeliant）產(chǎn)生基地，為提供無病毒良種種苗。5.無病毒良種種苗的特點產(chǎn)量提高：如草莓可增產(chǎn)20-30%，馬鈴薯可增產(chǎn)40%以上，地瓜脫毒提產(chǎn)30-50%。品質(zhì)提高：脫毒后的植物所結(jié)果實品質(zhì)提高，如地瓜脫毒可提高出干率0.1-1.5%。抗病性增強：對病蟲的抗性增強，如地瓜脫毒后可增強抗莖線蟲??；脫毒時還會脫除細(xì)菌、真菌、線蟲等。二、脫毒方法1.熱處理原理：植物組織處于高于正常溫度環(huán)境時，組織內(nèi)部的病毒受熱后鈍化，其復(fù)制功能受到影響，以致病毒含量不斷降低；甚至死亡，從而達(dá)到脫毒的目的。熱處理對葡萄扇葉病毒、蘋果花葉病毒、康乃馨病毒等一類的圓形或線性的病毒起作用。如：葡萄扇葉病毒在38℃處理30分鐘可脫除。1889年，瓜哇人用熱水浸甘蔗種，得到病毒減輕的甘蔗。最早熱處理脫毒是英國的卡尼斯（1950）：馬鈴薯塊莖37℃處理20天，卷葉病毒消失。熱處理脫毒方法溫水浸漬處理：適用于休眠器官，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時，簡單易行，但材料易受傷。熱空氣處理：將材料放在高溫生長室（在35-40℃），使其頂端分生組織比次生分生組織生長迅速，切取其莖尖分生組織進(jìn)行離體培養(yǎng)。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達(dá)數(shù)月。2.微莖尖脫毒越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染濃度越低，生長點（約0.1-1.0mm區(qū)域）則幾乎不含或含病毒很少。分生區(qū)域內(nèi)無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長速度。微莖尖培養(yǎng)脫毒案例3.愈傷組織脫毒原理從器官或組織誘導(dǎo)愈傷組織，分化不定芽，生根培養(yǎng)成植株，可獲脫毒苗。如馬鈴薯、大蒜、草莓、水仙、香蕉等。原理及依據(jù)：病毒在植物體內(nèi)的不同器官或組織分布不均勻，甚至在同一感病的組織內(nèi)，存在不感病毒的細(xì)胞群落。這些無病毒細(xì)胞在愈傷組織的增殖中獲得無病毒組織。病毒顆粒在愈傷組織的增殖過程中逐漸降低。繼代培養(yǎng)的愈傷組織產(chǎn)生抗性變異。技術(shù)關(guān)鍵：誘導(dǎo)可再生出植株的愈傷組織。愈傷組織脫毒案例4.珠心組織培養(yǎng)脫毒原理病毒是通過維管組織傳播的，而珠心組織與維管組織沒有直接聯(lián)系，故珠心組織培養(yǎng)可獲得無病毒植株。柑橘、葡萄，通過珠心組織培養(yǎng)獲得了無病毒植株。柑橘、葡萄，通過珠心組織培養(yǎng)獲得了無病毒植株。5.微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒特點：微體嫁接法是20世紀(jì)70年代發(fā)展的一種培養(yǎng)無病毒苗的方法，也稱試管嫁接?？砂褬O?。ㄐ∮?.2mm）莖尖，作為接穗嫁接到生長在試管中的實生砧木上（種子獲無菌苗實生苗不帶毒）。接穗在砧木的飼喂下很容易成活。接穗是很小的莖尖，帶毒概率小，可獲無毒苗。已在柑橘、蘋果上獲得成功。技術(shù)關(guān)鍵：剝離技術(shù)高：嫁接的成活率與接穗大小呈正相關(guān)，而脫毒率與及接穗大小呈負(fù)相關(guān)。莖尖大小：莖尖越小脫毒效果越好，小于0.2mm的莖尖嫁接可脫除多數(shù)病毒。培養(yǎng)基篩選：考慮砧木和接穗對營養(yǎng)的要求。接穗的取材季節(jié)：不同的取材季節(jié)嫁接成功率不同。4-6月份取材嫁接成活率較高。三、脫毒檢測1.視覺觀察法看植株莖、葉是否有該病毒所有的可見癥狀，受侵染的植株表現(xiàn)為局部或系統(tǒng)花葉、皺縮、卷葉、黃化等。生長勢減弱，有矮化或畸形等癥狀。2.生物鑒定法（指示植物法）原理：有些植物對病毒極為敏感，一旦感染病毒就會在其葉片乃至全株上表現(xiàn)特有的病斑，這種植物為病毒敏感植物或指示植物。例：馬鈴薯病毒的敏感植物有：千日紅、黃花煙、心葉煙、毛葉曼陀羅等鑒定法a.摩擦接種法b.嫁接鑒定法取待檢測植物的汁液，摩擦接種或?qū)⒋龣z植物接穗嫁接到對應(yīng)的敏感植物上，視其有無病斑，判斷是否脫毒病毒。3.電子顯微鏡鑒定法原理：用電鏡直接觀察經(jīng)脫毒培養(yǎng)的葉片，檢查是否有病毒粒子的存在，測量病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)。電鏡鑒定法是準(zhǔn)確、科學(xué)、先進(jìn)的檢測方法?？芍《绢w粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)?？贵w概念：當(dāng)動物被病毒感染或人工注射異體蛋白質(zhì)時，其體內(nèi)會產(chǎn)生一種特異性免疫球蛋白，其被稱為抗體。抗原概念：引起形成抗體的物質(zhì)（病毒或異體蛋白）。4.抗血清鑒定法血清反應(yīng)：抗體在特色細(xì)胞內(nèi)形成，進(jìn)入血液存在于血清和體液內(nèi)?？乖涂贵w相結(jié)合的反應(yīng)稱為血清反應(yīng)。含特異性“抗體”的血清稱為“抗血清”。特異性：抗原和抗體結(jié)合，有很強的特異性。即一種病毒產(chǎn)生的抗體只能結(jié)合該種病毒，用已知病毒的抗血清可鑒定未知病毒的種類。測定速度快，幾小時甚至幾分鐘就可完成。病毒抗血清在診斷上的價值病毒抗血清具有高度的?；裕阂环N病毒產(chǎn)生的“抗體”，只能結(jié)合該種病毒（抗原）。對于受感染而沒有癥狀的帶毒植物，也能診斷，有很高的實用價值。玻璃片凝聚法：在清潔玻璃片的一端，用毛細(xì)管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量對照血清。然后各加滴被檢植物壓榨出的原汁液兩滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置20-50min，然后在40-60倍顯微鏡下觀察。帶病毒的葉綠體發(fā)生典型的凝集現(xiàn)象。將抗原固定在酶標(biāo)板上，加入待測血清，然后再加入酶標(biāo)記的抗體，使之與待測血清中已與抗原結(jié)合的特異性抗體結(jié)合用酶標(biāo)儀作出判斷。該方法敏感，能檢測出【10】

（-5）數(shù)量級病毒濃度。5.分光光度計法用于定量病毒步驟：把病毒的純品干燥稱重配成已知濃度上午病毒算浮液在260nm下測其光密度并折算成消光系數(shù)查消光系數(shù)表四、無病毒種苗的保存和利用1、無病毒原種的保存無病毒苗原種要在隔離區(qū)或采用隔蟲網(wǎng)室種植保存。隔離區(qū)可為海島、山地、未種植過該種植物的新區(qū)；隔蟲網(wǎng)室用300網(wǎng)紗，防蚜蟲進(jìn)入。種植苗圃的土壤應(yīng)消毒，保證原種是在與病毒嚴(yán)密隔離的條件栽培。及時和定時對原種進(jìn)行病毒的檢測和測定。離體保存。種苗經(jīng)鑒定后，選擇無病原種株系，回接于試管內(nèi)，長期保存，是理