總RNA提取,cDNA文庫(kù)構(gòu)建和基因克隆

幾種分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹王義鵬2013年10月9日主要內(nèi)容RNA提取

cDNA文庫(kù)構(gòu)建基因克?。≒CR）RNA提取Trizol法提取RNA試劑和耗材準(zhǔn)備Trizol試劑氯仿異丙醇75%乙醇（DEPC處理水配制）DEPC處理水槍頭、PCR管（購(gòu)買商品化產(chǎn)品或DEPC水浸泡）操作步驟1.勻漿

單位樣品（50-100mg組織、3.5cm培養(yǎng)皿、5-10×106動(dòng)植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞、1×107細(xì)菌）加入1mlTRIZOL，充分吹打和研磨（首先在2mlEP管中加入少量TRIZOL，將組織樣品放入，用小剪刀盡量剪碎，然后轉(zhuǎn)移到研缽中充分研磨）。收集勻漿液，2-8℃，12000g離心10min。2.分相（phaseseparation）上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mlEP管，15-30℃放置5min，加入氯仿（0.2ml/1mlTRIZOL），蓋好管蓋，劇烈搖動(dòng)15秒，15-30℃放置2-3min。2-8℃，12000g離心15min。此時(shí)管內(nèi)液體分為三層：上層，中層和下層。RNA存在于無(wú)色上層水相（其體積大約為所用TRIZOL體積的60%，且其表面有一層脂肪），中層為蛋白，紅色下層為酚-氯仿相。3.RNA沉淀將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中（該步驟至關(guān)重要，盡量避免接觸蛋白相和脂肪），加入異丙醇（0.5ml/1mlTRIZOL）使RNA沉淀下來(lái)。15-30℃放置10min，2-8℃，12000g離心10min（離心前不可見，后成膠狀沉淀）。提前將異丙醇4℃預(yù)冷，或混勻后-20℃放置60min提取效果更好。4.洗滌RNA除去上層液體，加入75%乙醇（至少1ml乙醇/1mlTRIZOL）混勻，2-8℃，7500g離心5min（12000g離心后RNA不易溶解）。若RNA沉淀量多，可重復(fù)洗一次。5.RNA重溶棄去上層液體，將EP管在超凈工作臺(tái)通風(fēng)片刻，涼干RNA（空氣或真空干燥5-10min，不要真空離心干燥。不能太干，否則影響溶解）。用適當(dāng)體積的RNase-free水重新溶解所得RNA（所用體積要根據(jù)RNA量確定）。取少量RNA用DEPC水稀釋50倍測(cè)得率，取5ul跑電泳，其他-80℃保存。果實(shí)或種子：多糖/多酚應(yīng)用SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)——CreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit簡(jiǎn)介cDNA文庫(kù)：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，并將其引入到相應(yīng)的宿主細(xì)胞中（一般為E.coli.）繁殖和擴(kuò)增，理論上此群體就包含有該物種的全部mRNA信息，稱該生物基因組的cDNA文庫(kù)。簡(jiǎn)介cDNA文庫(kù)構(gòu)建的基本步驟：總RNA提??；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；cDNA第二鏈合成；接頭的加入；酶切及載體連接；導(dǎo)入宿主細(xì)菌；文庫(kù)的鑒定。簡(jiǎn)介常規(guī)建庫(kù)：加adaptor，相應(yīng)酶切后插入載體；低豐度或較長(zhǎng)信息丟失；加相同adaptor，因插入載體的方向性，可能有50%信息丟失；加不同adaptor，雙酶切問題影響產(chǎn)率。表達(dá)框架問題，正向插入后的正確產(chǎn)物幾率1/3。CreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit利用SMART技術(shù)建庫(kù)，可以得到全長(zhǎng)的cDNA文庫(kù)，也不需要Adaptor的連接。只需要少至25ng的mRNA或者50ng的TotalRNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA文庫(kù)，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度。簡(jiǎn)介SMART：SwitchingMechanismAt5’endsofRNATranscriptCreator系統(tǒng)，利用Cre-LoxP技術(shù)可將一個(gè)目的基因從單個(gè)供體質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入多種表達(dá)受體質(zhì)粒中，而無(wú)需進(jìn)行亞克隆。CreatorSMARTcDNA文庫(kù)構(gòu)建原理50ngoftotalRNAor

25ngofpolyA+RNA1μgpolyA+RNASynthesizefirst-strandcDNA

Synthesizefirst-strandcDNA

cDNASynthesisbyLDPCR

cDNASynthesisbyPrimerExtension

ElectrophoreseasampleonagelSfiIdigestioncDNAsizefractionation實(shí)驗(yàn)流程圖LigatecDNAtopDNR-LIBvectorTransformcellsandplateoutTheunamplifiedlibrary&check%recombinantclonesAmplifyandtiterlibrary續(xù)上頁(yè)1、第一鏈cDNA合成50ngoftotalRNAor25ngofpolyA+RNA適用于原始材料有限或RNA較難獲取的實(shí)驗(yàn)材料，但是如果起始RNA越多，PCR的循環(huán)數(shù)則越少，這樣可以減少非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增；反應(yīng)體系相同；但進(jìn)行下一步時(shí)只需用2μl的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其余可保存在-20℃冰箱內(nèi)（3個(gè)月）

1μgpolyA+RNA適用于RNA易于獲得的實(shí)驗(yàn)材料，但使用少于0.5μg或大于2.0μg的PolyA+RNA會(huì)降低克隆效率；在終止第一鏈合成反應(yīng)之后，加入1μl的NaOH，然后68℃下保溫30min。在下一步反應(yīng)中，全量（11μl）加入進(jìn)行第二鏈的合成。2、合成dscDNALDPCR法擴(kuò)增cDNA引物延伸法合成雙鏈cDNA不同的儀器要摸索一下最佳的循環(huán)數(shù)。此時(shí)獲得的dscDNA約2-3μg/50μl。1、2小結(jié)

容易遇到的問題無(wú)dscDNA產(chǎn)物dscDNA產(chǎn)物的片段偏小LDPCR中獲得dscDNA產(chǎn)物產(chǎn)量低或沒有可區(qū)分的亮帶引物延伸法獲得的dscDNA沒有可區(qū)分的亮帶分析原因和解決的辦法可能漏加反應(yīng)成分，只能重做起始材料RNA可能降解、不純，要重新制備RNA；可能是濃度過低，則增加RNA的加量；可能是穩(wěn)定性差，就要更換制備RNA的方法。1、循環(huán)數(shù)不夠，可導(dǎo)致產(chǎn)量低或片段大小<4kb或<2-3kb，增加循環(huán)數(shù)。2、第一鏈cDNA的產(chǎn)量低或起始的RNA量不足，導(dǎo)致產(chǎn)量低，從頭開始。3、如果整個(gè)smear比較亮而不可區(qū)分，可能是循環(huán)數(shù)太多，少2-3個(gè)循環(huán)重新合成第二鏈。4、電泳所用的瓊脂糖凝膠也可能改變條帶亮度，建議用1XTAE，1.1%-1.2%瓊脂糖，電壓60-90V。對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)源的RNA可能因結(jié)構(gòu)復(fù)雜而無(wú)亮帶；增加2-3個(gè)循環(huán)來(lái)重復(fù)引物延伸步驟；電泳所用的瓊脂糖凝膠也可能改變條帶亮度，建議用1XTAE，1.1%-1.2%瓊脂糖，電壓60-90V。3、蛋白酶K消化與酶切所用的dscDNA的量為50μl，加入2μl蛋白酶K消化，使DNA聚合酶失活。進(jìn)行純化，沉淀dscDNA時(shí)，注意要加入室溫下的95%乙醇，且室溫下離心，不要在離心前將試管置于冰上，以免因低溫導(dǎo)致雜質(zhì)的共沉。酶切后加入2μl

1%的二甲苯氰，作指示劑。4、cDNA片段的分級(jí)分離應(yīng)用CHROMASPIN-400Column上樣前的準(zhǔn)備：混勻柱子內(nèi)的基質(zhì)，去除氣泡；

去除底部封口，液體自然流出至流干，直

到看到基質(zhì)處于1ml刻度處；

流速大約1滴/40-60sec，每滴大約40μl。

當(dāng)儲(chǔ)備液流干后，加700μl緩沖液洗柱子。上樣：當(dāng)緩沖液停止流出15-20min后，加入樣品液。洗滌：保證樣品完全吸附于柱內(nèi)，再加入緩沖液洗滌。直至

液滴停止，此時(shí)染料帶進(jìn)入柱子幾毫米處。

洗脫：準(zhǔn)備好回收管，加入600μl緩沖液開始回收

（16）。檢測(cè)：每管3μl電泳，150V10min?；厥眨菏占琧DNA的前三管。濃縮、沉淀后，7μl溶解。

分級(jí)分離要注意的問題盡可能只收集前三管，避免混入小片段，以免影響載體連接，造成重組效率低。如果經(jīng)檢測(cè)有小片段沒有驅(qū)除干凈，要重復(fù)雙鏈合成和分級(jí)分離的話，要注意:不要讓基質(zhì)主體過干；柱子室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?；不要有氣泡；雙鏈混合物要混合均勻以免導(dǎo)致不能有效分離。5、連接與轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化

同時(shí)做陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞；

結(jié)果：陰性對(duì)照無(wú)菌落生長(zhǎng)；陽(yáng)性對(duì)照長(zhǎng)滿了菌落；

實(shí)驗(yàn)組平板上的菌落形成匯片，這樣的平板可包含幾千個(gè)菌落。

連接6、測(cè)定質(zhì)粒文庫(kù)滴度計(jì)算菌落數(shù)來(lái)確定文庫(kù)滴度coloniesonplate/[platingvolume(ml)xdilutionfactor]=cfu/ml注意：稀釋后的文庫(kù)會(huì)不夠穩(wěn)定，所以稀釋之后要盡快在滴度降低之前進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；使用推薦的抗生素濃度的培養(yǎng)基，以確保質(zhì)粒的穩(wěn)定性；通常情況下，用于長(zhǎng)期保存的質(zhì)粒文庫(kù)滴度要達(dá)到108cfu/ml。實(shí)驗(yàn)小結(jié)保證獲得數(shù)量足夠的高質(zhì)量的起始RNA。反轉(zhuǎn)錄成功與否及反轉(zhuǎn)錄效率是關(guān)鍵中的關(guān)鍵。層析柱cDNA分級(jí)很關(guān)鍵。這一步稍不注意會(huì)影響獲得的cDNA的片段分布特點(diǎn)。質(zhì)粒文庫(kù)對(duì)載體與cDNA的連接效率要求很高，也對(duì)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率要求很高?；蚩寺?PCR)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）：簡(jiǎn)稱PCR，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火和延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程，是一項(xiàng)在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR原理變性：95℃退火：60℃延伸：72℃PCR反應(yīng)五要素引物（primer）酶（DNApolymerase