墨蘭營劍白墨離體植株的誘導分化研究

墨蘭營劍白墨離體植株的誘導分化研究

墨蘭是中國著名的蘭花植物。它通常在春節(jié)前后開花，所以也被稱為報鄉(xiāng)蘭。墨蘭通常通過分段法繁殖。然而，由于種子數(shù)（每年3.4芽）和發(fā)芽速度緩慢，墨蘭的商業(yè)化生產(chǎn)和開發(fā)較少（墨蘭和其他蘭花植物），種子萌發(fā)緩慢，嚴重限制了墨蘭的生產(chǎn)和開發(fā)。正如其他蘭花科植物一樣，種子和胚胎發(fā)育不完全，沒有種子。在自然條件下，種子很難發(fā)芽。只有通過共生細菌才能發(fā)芽和形成幼苗。近年來，已經(jīng)報告了墨蘭種子、莖尖和幼花序的快速繁殖。然而，即使是優(yōu)良的細菌發(fā)芽和莖尖誘導的后代也形成了難以分化成形的幼苗，誘導率低，這增加了墨蘭組織培養(yǎng)的難度。還沒有關于墨蘭高速生產(chǎn)的報道。因此，我們研究了不同因素的轉為抑郁癥的影響，提高了墨蘭的快速繁殖和發(fā)芽率，為墨蘭的各種雜交和工具性育種提供了基礎。1材料和方法1.1試驗材料材料為企劍白墨種子誘導萌發(fā)的根狀莖.1.2試驗設計和試驗設計以MS為基本培養(yǎng)基,在MS中添加香蕉50g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L,pH5.4～5.6.試驗設計采用正交試驗(見表1,表2).1.3成苗率的測定將墨蘭企白根狀莖從原瓶中取出,用鑷子及刀片刮凈原培養(yǎng)基殘渣,并進行分切,取大小長短相近的根狀莖置于培養(yǎng)瓶中,每瓶5條,均勻放置;重復5次.將接種好的培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室中,在室溫條件下培養(yǎng);定時觀察記錄統(tǒng)計成苗率及新根狀莖數(shù).成苗率Ⅰ=已出芽的根狀莖數(shù)/接種根狀莖數(shù);成苗率Ⅱ=總出芽數(shù)/接種根狀莖數(shù).2結果與分析2.16不同濃度對墨蘭組物的影響6-BA、NAA、GA3、AgNO3的L9正交試驗結果見表3.由表3可知,在9種培養(yǎng)基中,P8和P9培養(yǎng)基的墨蘭根狀莖的成苗率較高,成苗率I均為0.36,成苗率II分別達0.68和0.60.在不添加上述4種成分的培養(yǎng)中中(P1),平均新增根狀莖數(shù)最高,達3.48條.圖1、圖2表示6-BA、AgNO3、GA3、NAA、NH4NO3、KH2PO4不同濃度對墨蘭根狀莖成苗率的影響.由圖1可知,隨著6-BA濃度的不斷增大(1mg/L→5mg/L→10mg/L),成苗率I、II均有所增加,而平均新增根狀莖數(shù)顯著降低.從圖2也可得出相同的結論.這說明6-BA濃度的增加,有利于墨蘭根狀莖的分化成苗.隨著AgNO3濃度的增加,成苗率I、II也有所增加,成苗率II增幅更明顯.而平均新增根狀莖數(shù)有所降低(圖1)則說明AgNO3對墨蘭根狀莖的成苗具一定的促進作用.隨著GA3濃度的逐步增加,成苗率I、II和平均新增根狀莖數(shù)均逐漸下降.說明培養(yǎng)基中添加GA3不僅不利于墨蘭根狀莖分化成苗,也不利于根狀莖的快速增殖.當培養(yǎng)基中NAA濃度在0～0.5mg/L時,企劍白墨的根狀莖成苗率無明顯的差異.但從圖2可知,NAA濃度的進一步增加(0～1mg/L),成苗率I和II均有增加,因此說明較高濃度的NAA也可以促進企劍白墨的根狀莖分化出苗.2.2nh4no3和kh2po4對墨蘭根生長的影響表4為NH4NO3、KH2PO4、6-BA和NAA的L9正交試驗結果.由表4可知,成苗率最高的培養(yǎng)基為C5,成苗率I、II分別達0.90、1.40.其次是C3,成苗率I、II分別為0.64和1.16.另外,從圖2中可看出,NH4NO3濃度保持MS的正常水平(1650mg/L)比較有利于墨蘭根狀莖的成苗,其濃度的減半或加倍,均不利于根狀莖成苗.但隨著NH4NO3濃度的增加,根狀莖的增殖率顯著下降.這說明MS培養(yǎng)基中的NH4NO3濃度減半,有利于根狀莖的增殖.將培養(yǎng)基中KH2PO4濃度提高,可以促進墨蘭根狀莖的出苗,其濃度以340mg/L為宜.KH2PO4對根狀莖的增殖無顯著影響.3墨蘭掃生長nh4no3的濃度對墨蘭組織化的影響中國蘭組織培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基較多,常用的是MS、White、VW、KC和Hyponex等.最適的培養(yǎng)基則因品種而異.有研究表明,春蘭要求無機鹽含量較低的培養(yǎng)基,以1/2MS為宜,而墨蘭、蕙蘭則要求無機鹽含量較高的培養(yǎng)基.NH4NO3是MS培養(yǎng)基中主要的無機成分,本試驗對培養(yǎng)基中的NH4NO3進行了1/2、1倍和2倍MS含量試驗,發(fā)現(xiàn)1倍MS含量的NH4NO3含量比較有利于墨蘭根狀莖分化出苗,1/2含量的NH4NO3則有利于根狀莖的增殖.這說明墨蘭根狀莖分化培養(yǎng)中的確需要較高的無機鹽濃度.朱根發(fā)等研究認為,培養(yǎng)基中KH2PO4濃度的提高,可促進白掌、綠帝王等花卉的快速繁殖.本試驗也發(fā)現(xiàn),將培養(yǎng)基中的KH2PO4濃度提高到340mg/L可促進墨蘭根狀莖的成苗.培養(yǎng)基中磷、鉀含量增加,可能有利于促進根狀莖萌芽的有關酶的表達,從而提高成苗率.用,而且生根數(shù)較少,培養(yǎng)18d后,出苗時根系較長,不利于移栽成活;0.1mg/L的NAA生根綜合情況最好,根數(shù)量較多,而且基部膨大;NAA濃度為0時也有69%的生根率,但生根較慢,根數(shù)量最少.在常規(guī)的組培生根培養(yǎng)中,以MS+NAA0.5mg/L為培養(yǎng)基時,生根率可達83%,但根數(shù)較少,基部鱗莖基本無膨大現(xiàn)象的發(fā)生.無糖生根培養(yǎng)的種苗質(zhì)量明顯優(yōu)于常規(guī)組培生根培養(yǎng)的種苗.3無糖培養(yǎng)的工程特點.用虎眼萬年青新萌發(fā)的葉片切塊作外植體在適宜的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng),可以對其進行快速繁殖.葉片的取材和消毒都十分方便,而且在取材過程中不損耗母株,適于引進品種的規(guī)?；敝撑c快速生產(chǎn).在虎眼萬年青的繼代增殖培養(yǎng)中,隨著繼代次數(shù)的增加,植株體內(nèi)會有一定的激素累積,須根據(jù)再生芽的生長狀況適時對培養(yǎng)基中激素濃度進行調(diào)整,逐步降低激素的用量,以保證種苗不發(fā)生變異,或僅僅發(fā)生很小的變異,不斷獲得健壯的繼代苗.在無糖培養(yǎng)