陜西棗瘋病發(fā)病規(guī)律與苗木帶病檢測

陜西棗瘋病發(fā)病規(guī)律與苗木帶病檢測吳寬;田小曼【摘要】從彬縣、佳縣和清澗縣采集的棗樹苗、酸棗苗、棗樹昆蟲樣品中提取總核酸,克隆與測序結(jié)果表明，陜西彬縣、佳縣和清澗縣3個棗區(qū)的棗瘋病(JWB)植原體16SrDNA基因大小為1.2kb,基因序列基本一致，為同一個種,JWB和酸棗(WJWB)植原體16SrDNA的親緣關(guān)系達(dá)到99.9%.由于JWB與16SrV組B亞組成員榆樹黃化(Elmyellows,EY)和懸鉤子叢枝病(Rubuswitches'broom,RuS)的同源性分別是98.5%和98.3%.因此,JWB歸屬于植原體16SrV組B亞組.PCR檢測苗木結(jié)果顯示,市場上的棗樹苗帶病較多,以佳縣棗樹苗的帶病率最高，達(dá)到7.69%,彬縣帶病率最低，為4.35%;清澗縣酸棗苗的帶病率最高，達(dá)到19.05%.對棗瘋病品種抗病性調(diào)查結(jié)果顯示，’婆棗’發(fā)病率較高(25.32%),‘晉棗’發(fā)病率最低(11.18%).對在彬縣與佳縣棗園采集的中華擬菱紋葉蟬(Hishimonoideschinensis)、凹緣菱紋葉蟬(Hishimonussellatus)、大青葉蟬(Cicadellaviridis)和條沙葉蟬(Psammotettixstriatus),用PCR檢測帶毒情況，結(jié)果顯示,只有中華擬菱紋葉蟬和凹緣菱紋葉蟬攜帶棗瘋病植原體，說明這兩種葉蟬是陜西的棗瘋病的媒介昆蟲.在溫室內(nèi)，采用菟絲子和嫁接方式，能夠傳播棗瘋病.【期刊名稱】《西北農(nóng)業(yè)學(xué)報》【年(卷)，期】2019(028)005【總頁數(shù)】6頁(P809-814)【關(guān)鍵詞】棗瘋病;病原學(xué);苗木帶毒；PCR檢測;病害侵染循環(huán)【作者】吳寬;田小曼【作者單位】楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程分院，陜西楊凌712100；楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程分院，陜西楊凌712100【正文語種】中文【中圖分類】S432.4棗原產(chǎn)于中國，已有8000余年的栽培歷史。中國的大棗生產(chǎn)居世界領(lǐng)先地位，占世界總產(chǎn)量的99%。1995年全國棗樹栽植面積達(dá)到66.67萬hm2，鮮棗總產(chǎn)突破7.8億kg。2016年中國的棗樹栽植面積達(dá)到150萬hm2,主產(chǎn)區(qū)在山東、河北、山西、陜西、新疆、河南，占全國產(chǎn)量的90%，陜西盛產(chǎn)大棗，遠(yuǎn)銷國內(nèi)外。然而，隨栽培面積擴(kuò)大，生產(chǎn)上危害最大的棗瘋病快速蔓延。長期以來，因?qū)υ摬『Φ陌l(fā)生規(guī)律、品種抗病性研究較少，對病害缺乏有效的防治措施，全國每年因棗瘋病死樹高達(dá)千萬株，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億元，嚴(yán)重阻礙棗樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［1］。因此，對陜西棗瘋病苗木帶病檢測與品種抗病性調(diào)查研究是棗生產(chǎn)中長期亟待解決的問題。多年來，國內(nèi)外已在棗瘋病的發(fā)生危害、抗生素治療、病原檢測、以及棗樹組培脫毒等方面開展了一些研究［2］。但是由于棗瘋病植原體(Phytoplasma)嚴(yán)格寄生于植物的韌皮部，不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，因而對其病原基因組、致病分子機(jī)理、控制技術(shù)的研究都比較缺乏。到目前為止，除日本、韓國對棗瘋病植原體的16SrDNA基因片段［3-4］有一些文獻(xiàn)報道外，王海妮等［1］對棗瘋病植原體16SrDNA基因序列和tuf基因的序列進(jìn)行報道和分類地位鑒定，吳寬等［5］克隆棗瘋病植原體核糖體蛋白基因(rp)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。本研究開展陜西棗瘋病苗木帶病檢測與品種抗病性調(diào)查，取得新的研究進(jìn)展。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。1材料與方法1.1材料2016-2018年對陜西彬縣、佳縣、清澗縣等地的棗瘋病發(fā)生現(xiàn)狀、影響因素進(jìn)行調(diào)查采樣，分別采集棗樹苗枝條165份，收集棗園酸棗枝條114份及棗樹病樹周圍的中華擬菱紋葉蟬(Hishimonoideschinensis)、凹緣菱紋葉蟬(Hishimonussellatus)、大青葉蟬(Cicadellaviridis)、條沙葉蟬(Psammotettixstriatus)等樣品30份。分子檢測所用的pMD18-Tsimplevector.H.Q.&.Q凝膠回收試劑盒為優(yōu)晶生物工程有限公司產(chǎn)品，Marker為DL-2000購于大連TaKaRa公司。EscherichiacoliJM109菌株、棗瘋病陽性對照均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院分子病毒學(xué)實驗室提供，分子檢測在該實驗室進(jìn)行。1.2方法1.2.1棗樹苗木與昆蟲樣品總DNA的提取參照文獻(xiàn)［1,6］,取棗樹和酸棗叢枝組織0.2g，或昆蟲樣品5~6頭，-80°C冰凍后充分研磨，加入0.5mLDNA提取緩沖液(20g/LCTAB、1.4mol/LNaCl、100mmol/LTris-HClpH8.0、50mmol/LEDTApH8.0、中=3%陽蔬基乙醇、20g/LPVP)和等體積的氯仿：異戊醇(24：1),在65C水浴中保溫提取30min，冷卻至室溫后，12000r/min離心10min，取上清液，再用等體積的氯仿：異戊醇(24：1)抽提至蛋白除盡。上清液加入2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，沉淀先后用中=70%乙醇和無水乙醇洗滌后,短暫干燥，加30pLTE溶解DNA。-20C冰凍保存，備用。1.2.2PCR擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)［3,7］報道的植原體16SrDNA序列通用弓物對R16mF2/R16mR1,R16F2/R16R2(由北京賽百盛公司合成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物對序列如下：R16mF2:5'-CATGCAAGTCGAACGGA-3',R16mR1:5'-CTTAACCCCAATCATCGAC-3',R16F2:5'-ACGACTGCTAAGACTGG-3',R16R2:5'-CGG-GGTTTGTACACACCGC-3',反應(yīng)體系為25pL。PCR產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)漠化乙錠染色后，在紫外透射燈下觀察。1.2.3基因克隆與核苷酸序列分析參考常規(guī)方法開展基因克隆［8］、分類鑒定［9-11］。把含有目標(biāo)外源片段的重組克隆送上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，用BLAST軟件進(jìn)行檢索，采用Mega6.0分析進(jìn)化關(guān)系。1.2.4菟絲子傳播將盆栽的健康長春花苗置于菟絲子周圍，將菟絲子的藤蔓一頭纏繞其上，待菟絲子完全寄生長春花后，從菟絲子藤蔓另一頭切斷。將寄生菟絲子的長春花苗盆移至棗瘋病株瘋枝周圍，懸掛固定，將菟絲子藤蔓纏繞在幼嫩瘋枝上，保持傳毒1.5個月。將長春花苗轉(zhuǎn)移溫室培養(yǎng)，除掉菟絲子，紗網(wǎng)防蟲，觀察長春花癥狀，PCR檢測確定是否傳毒成功。1.2.5嫁接傳播采用嵌芽法嫁接。剪取感染JWB長春花的病枝，切成1.5~2cm莖段留1個葉柄作為接穗，在接穗芽下部的背面斜削一刀成馬蹄形，再在另一面斜削長0.3~0.5cm，成楔形，然后插入健康長春花砧木的“T”字形切口皮下，用塑料薄膜條纏緊，將植株置于陰涼處，2d后放入溫室，約2周后接穗成活。2結(jié)果與分析2.1棗瘋病植原體16SrDNA基因的克隆與同源性分析對2016-2018年采集的陜西彬縣、佳縣、清澗縣的棗瘋病樣品總DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增與測序，結(jié)果表明：PCR產(chǎn)物健康植株未擴(kuò)增出特異性條帶(圖1),陜西彬縣、佳縣、清澗縣3個棗區(qū)的棗瘋病病原植原體的16SrRNA基因序列均為1.2kb,3個產(chǎn)區(qū)沒有株系分化現(xiàn)象。利用MEGA6.0軟件分析陜西3個JWB株系與國際基因庫(NCBI)中韓國、日本、印度等13個JWB植原體株系16SrRNA堿基序列的同源關(guān)系，獲得進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示，棗樹JWB和酸棗棗瘋病(WJWB)植原體16SrRNA高度一致，同源性達(dá)到99.9%,JWB與16SrV組B亞組成員榆樹黃化(EY)和懸鉤子叢枝病(RuS)的同源性分別是98.5%和98.3%?？梢娖鋵儆?6SrV組B亞組。2.2苗木帶病分子檢測從彬縣、佳縣、清澗縣采集的棗樹苗木樣品，采用植原體16SrDNA序列通用引物對R16mF2/R16mR1、R16F2/R16R2進(jìn)行PCR分子檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)市場上的棗樹苗部分帶有棗瘋病，以佳縣棗樹苗的帶病率最高，達(dá)到7.69%，彬縣帶病率最低，為4.35%；棗園酸棗經(jīng)過分子檢測發(fā)現(xiàn)帶病較多，以清澗縣酸棗苗的帶病率最高，達(dá)到19.05%（表1）。說明棗樹苗隱性帶病現(xiàn)象普遍，要選擇無病、健壯棗樹苗木建園是防止大面積發(fā)病的重要措施。2.3棗瘋病發(fā)病規(guī)律研究2016-2018年對陜西彬縣、佳縣、清澗縣的棗瘋病進(jìn)行監(jiān)測調(diào)查，結(jié)果表明：棗瘋病每年5月中下旬開始表現(xiàn)癥狀，7月后癥狀逐漸明顯，顯現(xiàn)典型的簇狀黃化、小葉、叢枝癥狀，伴有芽的不正常萌發(fā)和花器退化成葉片。1a生發(fā)育枝的芽萌發(fā)成叢生枝、節(jié)間短、萎縮黃化。開花以后葉片發(fā)生明顯病變，先是葉肉變黃，逐漸全葉黃化,黃化后葉緣上卷，質(zhì)地變脆，翠綠焦枯脫落，其他枝條葉片呈現(xiàn)黃綠相間的花葉（圖3）。對葉片中提取的植原體16SrDNA條帶檢測發(fā)現(xiàn)，植原體在植物體內(nèi)的含量呈現(xiàn)季節(jié)性波動，春夏季節(jié)幼嫩組織植原體含量較高，而秋冬季老葉片與樹皮韌皮部組織，植原體含量會明顯降低。同時，調(diào)查還發(fā)現(xiàn)棗園酸棗發(fā)病率高時棗瘋病發(fā)生嚴(yán)重，說明通過昆蟲介體棗瘋病在棗樹與酸棗間相互傳播，酸棗棗瘋病株已經(jīng)成為棗園棗瘋病的一個重要初侵染源。2.4品種抗病性調(diào)查對陜西大棗主產(chǎn)區(qū)棗瘋病調(diào)查結(jié)果顯示，’砘子棗’’馬牙棗’’婆棗’發(fā)病率依次為19.38%、21.25%、25.32%，其次為’酸鈴棗’‘紅平棗’‘黃河灘棗’‘長紅棗’’木棗’，發(fā)病率依次為15.65%、14.47%、14.38%、13.75%和13.13%，’晉棗’發(fā)病率最低，為11.18%。說明棗樹品種間對棗瘋病抗病性存在明顯差異。對’晉棗’樹齡與發(fā)病率關(guān)系調(diào)查發(fā)現(xiàn)，樹齡的長短影響發(fā)病率，7-10a樹齡發(fā)病率為3.15%~8.12%,15-20a樹齡發(fā)病率為9.26%~11.85%,有些老棗園達(dá)到25.64%~31.36%。M.標(biāo)準(zhǔn)DNADL-2000DNAmarker;1~3.分別來自彬縣、佳縣、清澗縣的棗樹苗JujubestocksfromBinxian,Jiaxian,Qingjianxianrespectively;4~6.分別U來自3個縣的酸棗苗Wildjujubestocksfrom3countiesabove;7~10.分別U來自3個縣的健康棗樹苗Healthyjujubestocksfrom3countiesabove;9.陽性棗瘋病株P(guān)ositiveJWBstocks圖1棗樹苗木與酸棗中JWB植原體的PCR檢測Fig.1PCRdetectionofJWBphytoplasmainstocksofjujubeandwildjujube圖2JWB植原體16SrDNA序列的同源進(jìn)化樹Fig.2DendrogramofJWBphytoplasma16SrDNAsequences表1苗木帶病率檢測Table1TherateofjujubestockscarryingJWB棗區(qū)Jujuberegion彬縣Binxian棗樹Jujube酸棗Wildjujube佳縣Jiaxian棗樹Jujube酸棗Wildjujube清澗縣Qingjianxian棗樹Jujube酸棗Wildjujube總株數(shù)Totalplants463852346742帶病株數(shù)PlantscarryingJWB254658帶病率/%Rateofdiseasedplants4.3513.167.6917.657.4619.052.5媒介昆蟲帶毒檢測與傳毒循環(huán)規(guī)律調(diào)查在陜西彬縣、佳縣棗園采集的中華擬菱紋葉蟬(H.chinensis)、凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)、大青葉蟬(C.viridis)、條沙葉蟬(P.striatus),用PCR檢測帶毒情況，結(jié)果顯示，中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬攜帶棗瘋病植原體，說明這兩種葉蟬是陜西棗區(qū)棗瘋病的媒介昆蟲(圖3)。監(jiān)測調(diào)查中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬的生活習(xí)性與傳毒規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在春季、夏季中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬主要生活在棗樹上，在嫩葉上取食、產(chǎn)卵繁殖，同時，一些中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬轉(zhuǎn)主寄生在棗園雜草或周邊的胡蘿卜、芹菜、茄子等作物上。進(jìn)入秋季氣溫逐漸降低，一些媒介昆蟲遷飛到地面雜草、三葉草、苜蓿、禾谷類作物上，在干草上產(chǎn)卵越冬，待春季氣候溫暖時孵化，葉蟬遷飛返回到棗樹嫩葉上生活，完成生活史。同時，葉蟬從發(fā)病樹取食攜帶病原，遷飛到地面中間寄主時將病害傳播過去，來年春季葉蟬遷飛返回到棗樹又將病原帶回棗樹，完成棗瘋病的一個侵染循環(huán)。葉蟬通過持久性方式傳播棗瘋病，成蟲和幼蟲均能傳病，雌雄交配后雌蟲產(chǎn)的卵，植原體不能入侵，所以卵孵化的幼蟲不再帶毒。2.6菟絲子和嫁接傳播在溫室內(nèi)，采用菟絲子接種傳毒，接種1.5個月，長春花表現(xiàn)叢枝癥狀，表明菟絲子將棗瘋病從棗樹病株傳播到健康幼苗上（圖4-A）。另外，將發(fā)病的長春花幼芽作接穗嫁接到健康長春花上，接種2個月后，健康長春花幼苗逐漸出現(xiàn)叢枝小葉癥狀（圖4-B），說明在長春花上嫁接能夠傳播棗瘋病。M.DL-2000DNAmarker;泳道1.大青葉蟬C.viridis;2.中華擬菱紋葉蟬H.chinensis;3.條沙葉蟬P.striatus;4.凹緣菱紋葉蟬H.sellatus;5.健康菟絲子Healthydodder;6~7.菟絲子傳播感染的長春花Dodder-infectedperiwinkle;8~9.嫁接感染的長春花Graft-infectedperiwinkle;10.健康長春花Healthyperiwinkle圖3棗瘋病植原體16SrRNA基因的PCR檢測Fig.3PCRdetectionof16SrRNAgeneinJWBphytoplasmaA.菟絲子傳播感染的長春花Periwinkleinfectedbydoddertransmission;B.嫁接傳播感染的長春花（左為嫁接，右為健康）Periwinkleinfectedbygrafttransmission（Graftedonleftandhealthyonright）圖4棗瘋植原體的菟絲子和嫁接傳播Fig.4TransmissionofJWBphytoplasmabydodderandgrafted3討論20世紀(jì)50年代以來，一些研究單位先后開展棗瘋病的危害調(diào)查、病原存在部位的熒光觀察、傳毒昆蟲種類鑒定、抗生素防治等試驗，但是從分子水平上對棗瘋病的苗木帶病檢測、初侵染源、果園病害循環(huán)、媒介昆蟲生活史等方面進(jìn)行的研究還比較少。本試驗對陜西省3個主產(chǎn)區(qū)棗瘋病的發(fā)生危害、核苷酸序列測定及病原進(jìn)化關(guān)系、果園病害循環(huán)、品種抗病性、苗木帶毒檢測、菟絲子傳播等進(jìn)行研究，取得新的研究結(jié)果。3.1棗瘋病病原的16SrRNA基因序列分析與病害侵染循環(huán)對3個主產(chǎn)區(qū)棗瘋病植原體16SrRNA基因序列分析，結(jié)果表明，目前陜西省3個主產(chǎn)區(qū)棗瘋病植原體高度一致，沒有分化；棗瘋病植原體和酸棗叢枝病植原體病原一致，隸屬于16SrV組B亞組，與榆樹黃化(EY)親緣關(guān)系最近。分子檢測證明中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬能夠攜帶傳播棗瘋病。兩種葉蟬的寄主有棗樹、胡蘿卜、芹菜、茄子、三葉草、苜蓿、禾谷類等。葉蟬從發(fā)病樹取食攜帶病原，遷飛到地面中間寄主時將病害傳播過去，來年春季葉蟬遷飛返回到棗樹又將病原帶回棗樹，完成棗瘋病的一個侵染循環(huán)。3.2苗木帶毒與菟絲子傳播檢測、品種抗病性調(diào)查從彬縣、佳縣、清澗縣采集的棗樹苗樣品，采用植原體16SrDNA序列進(jìn)行PCR分子檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，市場上出售的棗樹苗帶病普遍，以佳縣棗樹苗的帶病率最高，達(dá)到7.69%，彬縣帶病率最低，為4.35%；棗園酸棗帶病較多，以清澗縣酸棗苗的帶病率最高，達(dá)到19.05%，說明棗樹苗隱性帶病普遍，所以，建議對棗園周邊的酸棗，要每年清除，清潔田園，減少初侵染源。新建棗園時，要選擇脫毒、健壯棗樹苗木栽植，以防止大面積發(fā)病。另外，避免在棗園周邊種植蔬菜、苜蓿、牧草、果樹，阻斷棗瘋病傳播介體的轉(zhuǎn)主寄主與越冬場所，遠(yuǎn)離棗瘋病的帶毒寄主，減少循環(huán)侵染，為棗瘋病的持續(xù)控制提供技術(shù)支撐。參考文獻(xiàn)：【相關(guān)文獻(xiàn)】王海妮，吳云鋒,安鳳秋，等.棗瘋病和酸棗叢枝病植原體16SrDNA和tuf基因的序列同源性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(10):2200-2205.WANGHN,WUYF,ANFQ,etal.Thehomologyanalysisforsequencesof16SrDNAandtufgeneofphytoplasmafromjujubewitches’broomandwildjujubewitches’broom[J].ScientiaAgriculturaSinica,2007,40(10):2200-2205.陳妮，劉永光,仇平平，等.山東省棗瘋病植原體的鑒定及分子變異[J].植物病理學(xué)報,2015,45(2):113-120.CHENN,LIUYG,QIUPP,etal.Molecularidentificationandsequencepolymorphismofphytoplasmaassociatedwithjujubewitches’broominShangdongprovince[J].ActaPhytopathologicaSinica,2015,45(2):113-120.LEEIM,HAMMONDRW,DAVISRE,etal.Universalamplificationandanalysisofmycoplasmalikeorganisms[J].Phytopathology,1993,83:834-842.MARCONEC,LEEIM,DAVISRE,etal.Classificationofasteryellows-groupphytoplasmasbasedoncombinedanalysesofrRNAandtufgenesequences[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2000,50:1703-1713.吳寬，顏永杰,王海妮，等.西北旱區(qū)棗瘋病植原體核糖體蛋白基因的生物信學(xué)分析[J],干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2010,28(3):265-268.WUK,YANYJ,WANGHN,etal.BioinformaticsanalysisofribosomalproteingeneofJWBphytoplasmainthenorthwesternaridregions[J].AgriculturalResearchintheAridAreas,2010,28(3):265-268.KIRKPATRICKBC,STENGERDC,MORRIST,etal.CloninganddetectionofDNAfromanonculturableplantpathogenicmycoplasma-likeorganism[J].Science,1987,238:197-200.BAKWC,LAYJ.Fluoresensemicroscopicdiagnosisofmycroplasmainfectionsinjujube,mulberryandperiwinkleplantsKorean[J].PlantPathology,1985,1(1):12-16.DAVIAR