抗人乳腺癌單克隆抗體m4g3在以腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌為首發(fā)癥狀的隱性乳腺癌診斷中的應(yīng)用

抗人乳腺癌單克隆抗體m4g3在以腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌為首發(fā)癥狀的隱性乳腺癌診斷中的應(yīng)用

腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤是第一個(gè)癥狀的乳腺癌，被稱為隱形乳細(xì)胞癌。我們采用抗人乳腺癌單克隆抗體M4G3檢測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌,并結(jié)合全乳腺大切片方法,對(duì)此進(jìn)行研究。材料和方法1.小鼠體內(nèi)糖蛋白抗體的構(gòu)建本研究中使用的特異性單抗M4G3為我院生化室制備的一種抗人乳腺癌特異糖蛋白單抗。從新鮮乳腺癌組織提取液中得到膜抗原和可溶性抗原,純化后使特異糖蛋白相對(duì)濃度增加,再通過(guò)免疫小鼠生成抗乳腺癌特異糖蛋白抗體,利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)及免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行篩選,其后進(jìn)行4次再克隆,最后獲得1株特異的單抗生成細(xì)胞系,命名為M4G3,經(jīng)純化和鑒定后用于免疫組織化學(xué)研究。2.他部位腫瘤的診斷對(duì)本院收治的已經(jīng)病理確診的各類型乳腺癌37例行M4G3免疫組織化學(xué)檢測(cè),均為陽(yáng)性,強(qiáng)度為(+～+++)。對(duì)其他部位如胃、腸、卵巢、甲狀腺、肝、肺、腎等的原發(fā)性惡性腫瘤21例的檢測(cè)僅2例為陽(yáng)性(甲狀腺、賁門(mén)),其他部位良性腫瘤或非癌性病變檢測(cè)均為陰性。檢測(cè)乳腺良性腫瘤或增生性病變9例,其中僅2例為M4G3陽(yáng)性。對(duì)30例已確診乳腺內(nèi)有原發(fā)癌灶同時(shí)腋淋巴結(jié)陽(yáng)性的病例,腋淋巴轉(zhuǎn)移癌M4G3檢測(cè)全部陽(yáng)性。由此可證實(shí)M4G3對(duì)于乳腺癌具有特異性。3.分離株dab1991年1月～2002年1月我院收治此類病例62例,經(jīng)查體乳腺未觸及明確腫物,X線、B超或CT檢查未發(fā)現(xiàn)乳腺腫物,也除外其他部位的可疑病灶。陽(yáng)性腋淋巴結(jié)蠟塊4μm厚切片,脫蠟水化,3%甲醇過(guò)氧化氫處理,10%正常血清封閉,M4G3一抗1∶20,4℃孵育過(guò)夜,經(jīng)二抗、三抗結(jié)合,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。癌細(xì)胞胞漿呈棕黃色為M4G3陽(yáng)性細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥20%為M4G3反應(yīng)陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥20%～〈45%為+,≥45%～〈70%為++,≥70%為+++。4.患者和家屬同意同側(cè)乳腺癌根治術(shù)或仿根治術(shù)對(duì)上述檢測(cè)中腋淋巴結(jié)M4G3陽(yáng)性的病例經(jīng)患者及家屬同意行同側(cè)乳腺癌根治術(shù)或仿根治術(shù)。對(duì)M4G3陰性病例重新復(fù)習(xí)病理切片,根據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)建議進(jìn)一步檢查其他臟器或部位。5.大切片檢查及診斷首先對(duì)上述M4G3陽(yáng)性并行根治術(shù)的病理標(biāo)本作詳盡的肉眼檢查,方法為:新鮮標(biāo)本行腋淋巴結(jié)解剖后,剪除胸肌和周?chē)窘M織,經(jīng)-20℃凍硬,每隔0.5cm連續(xù)片狀切成11～30片/例。將標(biāo)本平鋪于工作臺(tái)上,用肉眼仔細(xì)觀察,對(duì)于可疑部位行快速冰凍檢查或制成普通石蠟切片,平均取材13塊/例,在光鏡下觀察診斷。對(duì)于用該法仍未找到乳腺實(shí)質(zhì)內(nèi)原發(fā)癌灶病例的標(biāo)本做全乳腺大切片檢查:切塊大小為7.0cm×2.0cm×0.5cm～12.0cm×4.5cm×0.5cm,平均23片/例。福馬林固定48h,梯度乙醇脫水144h,浸蠟96h,石蠟包埋。Lietz1400型巨塊切片機(jī)切片,蘇木素-伊紅(HE)染色。6.雌激素er和雌激素pgr的檢測(cè)對(duì)部分腋淋巴結(jié)M4G3陽(yáng)性病例采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ER、PgR的表達(dá)水平,以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥15%為ER/PgR陽(yáng)性反應(yīng)。7.肺癌轉(zhuǎn)移癌的診斷與鑒別診斷全部M4G3陽(yáng)性病例作隨訪觀察。方法為X線、核磁共振,CT、B超、核素?cái)鄬訏呙?ECT)等。如發(fā)現(xiàn)可疑轉(zhuǎn)移癌,可采用針吸等方法確定轉(zhuǎn)移癌的診斷。M4G3陰性病例也繼續(xù)追蹤觀察。8.統(tǒng)計(jì)評(píng)估采用Spearman相關(guān)分析法分析M4G3和ER/PgR表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果1.小巢狀或見(jiàn)前巢狀在淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)移癌組織排列成不規(guī)則小片塊小巢狀或彌散分布或大片塊狀,甚至占據(jù)整個(gè)淋巴結(jié)。部分病例陽(yáng)性淋巴結(jié)中癌細(xì)胞排列模仿粉刺樣導(dǎo)管癌形態(tài)(圖1～7)。2.胞漿的制備M4G3免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性反應(yīng)定位于癌細(xì)胞胞漿中,呈棕黃色。本組62例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌M4G3陽(yáng)性者58例,陽(yáng)性率為93.55%,陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度為+8例,++19例,+++31例。3.乳腺癌大切片檢查病例呈登記與檢測(cè)的格局M4G3陽(yáng)性的58例中有52例經(jīng)患者及家屬同意行乳腺癌根治術(shù)或仿根治術(shù)。全乳腺標(biāo)本經(jīng)詳細(xì)巨檢有17例找到乳腺實(shí)質(zhì)內(nèi)原發(fā)癌灶,占全部手術(shù)病例的32.69%(17/52)。其余35例繼續(xù)行全乳腺大切片檢查,27例可找到乳腺實(shí)質(zhì)內(nèi)的原發(fā)癌灶,為做大切片檢查病例的77.14%(27/35)。病理檢查乳腺內(nèi)原發(fā)癌總檢出率為84.62%(44/52),即本組有44例通過(guò)上述一系列檢查被確診為乳腺癌。大切片仍未找到乳腺內(nèi)原發(fā)癌者8例,其中5例可見(jiàn)重度乳頭狀瘤病/重度導(dǎo)管上皮增生,其余3例可見(jiàn)輕度/中度乳頭狀瘤病改變。4.細(xì)胞、竇組織細(xì)胞ER、PgR免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性反應(yīng)定位于癌細(xì)胞胞核中,呈棕黃色,淋巴細(xì)胞、竇組織細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)著色。本組檢測(cè)32例ER、PgR,陽(yáng)性率分別為62.50%(20/32)和68.75%(22/32)。5.正相關(guān)性和be多數(shù)M4G3表達(dá)陽(yáng)性者的ER和PgR也為陽(yáng)性,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有正相關(guān)性[r1=0.394(M4G3和ER),P1=0.026;r2=0.357(M4G3和PgR),P2=0.045]。6.原發(fā)癌灶和轉(zhuǎn)移癌隨訪1～11年,分別有以下幾種情況:(1)術(shù)后找到原發(fā)癌灶44例中,預(yù)后差發(fā)生轉(zhuǎn)移或因該病死亡13例。其余31例預(yù)后良好(70.45%,31/44),其中20例術(shù)后無(wú)瘤生存>5年。(2)術(shù)后未找到原發(fā)癌灶的8例中3例分別術(shù)后2、3、5年死亡,未發(fā)現(xiàn)其他部位原發(fā)癌灶。另外5例分別術(shù)后3～9年無(wú)瘤生存。(3)M4G3檢測(cè)陽(yáng)性但未行手術(shù)治療的6例患者,其中5例死亡,未發(fā)現(xiàn)其他部位原發(fā)癌灶。另1例轉(zhuǎn)移癌類型為粘液腺癌,腋下切檢術(shù)后5年仍健在。(4)M4G3檢測(cè)陰性4例,分別1例術(shù)后1年出現(xiàn)肺癌、1例術(shù)后1.5年出現(xiàn)汗腺癌、1例死于他病、1例無(wú)瘤生存。被檢測(cè)的er、pgr檢測(cè)情況我們?cè)诒狙芯恐兴玫目谷巳橄侔﹩慰寺】贵wM4G3,是經(jīng)過(guò)大量反復(fù)篩選再克隆過(guò)程,得到的可與人乳腺癌細(xì)胞中靶抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體。本研究結(jié)果顯示,M4G3的應(yīng)用對(duì)輔助確定轉(zhuǎn)移癌的組織來(lái)源,可較準(zhǔn)確的判斷轉(zhuǎn)移癌是否來(lái)自乳腺,為隱性乳腺癌的手術(shù)治療提供較為可靠的依據(jù)。本研究結(jié)果提示,M4G3與ER、PgR表達(dá)呈顯著正相關(guān),可在檢測(cè)M4G3同時(shí)檢測(cè)ER、PgR作為有益的補(bǔ)充。但ER、PgR陰性的病例只要M4G3陽(yáng)性也不能排除隱性乳腺癌。我們通過(guò)細(xì)致的病理學(xué)檢查,特別是通過(guò)全乳腺大切片檢查,進(jìn)一步證實(shí)M4G3的特異性。本組中5例M4G3陽(yáng)性經(jīng)大切片檢查雖未能找到原發(fā)癌灶,但可見(jiàn)屬于癌前病變的重度乳頭狀瘤病和/或重度導(dǎo)管上皮增生