l-賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品的含量測(cè)定

l-賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品的含量測(cè)定

氨基酸硫酸鹽（l-lysine）是一種新型的氨基酸產(chǎn)品，正在迅速普及。它是一種褐色粒狀的物質(zhì),其游離賴(lài)氨酸含量為50%。由于未經(jīng)離子交換純化過(guò)程,這種新型的賴(lài)氨酸含有生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的多種必需氨基酸的酵解物。因此,與L-lysine·HCL相比,L-lysine·H2SO4表現(xiàn)出更為廉價(jià)和環(huán)保的特點(diǎn)。L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽與L-賴(lài)氨酸硫酸鹽從名稱(chēng)上看差別不大,但實(shí)際上產(chǎn)品質(zhì)量特點(diǎn)存在很大差異,即使是不同廠家生產(chǎn)的L-賴(lài)氨酸硫酸鹽,產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)也存在一定的差異。相對(duì)于鹽酸鹽產(chǎn)品而言L-賴(lài)氨酸硫酸鹽為新的產(chǎn)品,隨著L-賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品用量的不斷增加,由于有些飼料企業(yè)對(duì)這些產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)了解不夠深入細(xì)致,出現(xiàn)含量不足等質(zhì)量問(wèn)題,導(dǎo)致其與供應(yīng)商間產(chǎn)生許多質(zhì)量爭(zhēng)議或糾紛。結(jié)合實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn),在L-賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)還沒(méi)有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的情況下,選擇一個(gè)合適的檢測(cè)方法測(cè)定氨基酸含量,特別是賴(lài)氨酸的含量是非常必要的。本研究通過(guò)氨基酸分析儀法和茚三酮比色法兩種檢測(cè)法,比較分析JL-賴(lài)氨酸硫酸鹽含量檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn),將為L(zhǎng)-賴(lài)氨酸硫酸鹽的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。1材料和方法1.1材料和試劑L-賴(lài)氨酸菌體發(fā)酵液:中糧生化發(fā)酵車(chē)間;L-賴(lài)氨酸硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品:上海生工公司;各種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品:上海生工公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1l-工業(yè)氨基酸菌體的酸水解取中糧生化發(fā)酵車(chē)間L-賴(lài)氨酸菌體發(fā)酵液樣品1.0L,離心6000rpm,10min處理,分別獲得發(fā)酵液上清和L-賴(lài)氨酸菌體,上清液進(jìn)行冷凍干燥處理,獲得賴(lài)氨酸硫酸鹽成品粉末,稱(chēng)取上清液樣品0.2500g(準(zhǔn)確至0.0002g),分別進(jìn)行10-1,10-2,10-3,10-4稀釋。各稀釋后樣品分別取做三個(gè)平行。獲得的L-賴(lài)氨酸菌體樣品酸水解處理:稱(chēng)取100mg賴(lài)氨酸菌體樣品置安瓿瓶中,加6mol/L鹽酸5mL,抽真空立即封管,放入烘箱,在110℃下水解24h,冷卻后打開(kāi)水解管轉(zhuǎn)移至小燒杯中,水浴揮干鹽酸,再用水洗數(shù)次,徹底揮干鹽酸,用0.1mol/L鹽酸溶解,定容至25mL,0.45μm濾膜過(guò)濾,濾液備用。上述發(fā)酵液上清樣品和L-賴(lài)氨酸菌體樣品分別采用茚三酮顯色檢測(cè)法和氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)法。1.2.2氨基酸待測(cè)液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品(預(yù)先在(105±2)℃恒重)1.0000g(精確至0.0002g)于100mL的燒杯中,用蒸餾水溶解后,全部轉(zhuǎn)移至1000mL的容量瓶中,定容搖勻。再將標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行稀釋,得到20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL標(biāo)準(zhǔn)濃度系列。分別移取不同稀釋梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液1mL到三支比色管內(nèi),加1mL茚三酮顯色劑,蓋好塞子。將其置于90℃下水浴20-25min,冷卻至室溫,用7200型分光光度計(jì)在475nm下測(cè)得其光密度值,并同時(shí)移取1mL蒸餾水與1mL茚三酮作空白實(shí)驗(yàn),以標(biāo)準(zhǔn)液的光密度值和濃度做一標(biāo)準(zhǔn)曲線。在這個(gè)過(guò)程中,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和樣品的測(cè)定需要同步進(jìn)行。由以上所得標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)查得待測(cè)稀釋液的濃度,再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品中總氨基酸待測(cè)液的濃度。用空白作參比,在475nm下用分光光度計(jì)測(cè)吸光度。用Excel軟件做標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用參考文獻(xiàn)的方法(見(jiàn)圖1)。1.2.3ph值、溫度和色譜條件試劑配制。內(nèi)標(biāo)溶液:稱(chēng)取58.6mgL-賴(lài)氨酸溶于50mL0.1mol/LHCI溶液中,配成10mmol/L貯備液,0℃-4℃保存。使用時(shí),用0.1mol/LHCI稀釋至1mmol/L。樣品前處理。稱(chēng)取試樣約250mg(精確至0.0001g)2份,分別置于20mL水解管中,加10.0mL酸解劑,抽真空,封口。將水解管放在110℃恒溫干燥箱中,水解22h。取出水解管,冷卻,開(kāi)管,過(guò)濾至25.0mL容量瓶中用6.0mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性,用去離子水定容,冷卻,混勻,用0.45μm濾膜過(guò)濾,取1.0mL濾液與上機(jī)用鹽酸溶液等體積混合,供上機(jī)使用。色譜條件。色譜條件參照張秀堯方法,泵1(洗脫溶液)流速:0.40mL/min(壓力2.0-14.7MPa);泵2(茚三酮溶液)流速:0.35mL/min(壓力0.2-2.0MPa);分析柱溫度:57.0℃;反應(yīng)器溫度:136℃;進(jìn)樣體積:20.0μL。檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm。2結(jié)果與分析2.13三酮法2.1.13采用三酮法測(cè)定氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線2.1.2發(fā)酵液中氨基酸含量豐原集團(tuán)不同檢測(cè)部門(mén)同用茚三酮比色法測(cè)量發(fā)酵液上清中賴(lài)氨酸含量,研發(fā)部門(mén)檢測(cè)3個(gè)平行樣品,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1,測(cè)得賴(lài)氨酸含量平均值為52.32%;豐原集團(tuán)分廠1檢測(cè)3個(gè)平行樣品,測(cè)得賴(lài)氨酸含量平均值為51.44%;豐原集團(tuán)分廠2檢測(cè)3個(gè)平行樣品,測(cè)得賴(lài)氨酸含量平均值為51.88%,各個(gè)部門(mén)用茚三酮比色法測(cè)量發(fā)酵液上清中賴(lài)氨酸含量的具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。豐原集團(tuán)不同檢測(cè)部門(mén)同用茚三酮比色法測(cè)量發(fā)酵液中賴(lài)氨酸菌體水解液賴(lài)氨酸含量,研發(fā)部門(mén)檢測(cè)3個(gè)平行樣品,測(cè)得賴(lài)氨酸含量平均值為10.27%;豐原集團(tuán)分廠1檢測(cè)3個(gè)平行樣品,測(cè)得賴(lài)氨酸含量平均值為9.78%;豐原集團(tuán)分廠2檢測(cè)3個(gè)平行樣品,測(cè)得賴(lài)氨酸含量平均值為10.21%,各個(gè)部門(mén)用茚三酮比色法測(cè)量發(fā)酵液中賴(lài)氨酸菌體水解液賴(lài)氨酸含量的具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。從表1、表2可以看出,三個(gè)檢測(cè)部門(mén),同是采用茚三酮比色法,因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線范圍、蒸煮時(shí)間、補(bǔ)加蒸餾水的體積不一樣,檢測(cè)結(jié)果不一致,這是方法誤差,和試劑、儀器、操作過(guò)程有關(guān)。2.2氨基酸分析儀的測(cè)量方法2.2.1l-硫酸硫酸成品的理化性質(zhì)豐原集團(tuán)生化中心發(fā)酵液樣品經(jīng)處理后,獲得的L-賴(lài)氨酸硫酸鹽成品,制成3組平行樣,經(jīng)高效液相色譜分析,賴(lài)氨酸的平均含量為51.2%,其他氨基酸總和在9.45%-10.44%,L-賴(lài)氨酸硫酸鹽成品中除賴(lài)氨酸外,還有17種其他氨基酸組分。其他氨基酸總和在9.45%-10.44%,一般要求其他氨基酸含量≥10%。具體每種氨基酸含量如表3。2.2.2氨基酸的測(cè)定豐原集團(tuán)生化中心發(fā)酵液樣品經(jīng)處理后,獲得的賴(lài)氨酸菌體酸水解液,經(jīng)高效液相色譜分析如圖2,各種氨基酸含量見(jiàn)表4。從表4可以看出,賴(lài)氨酸菌體經(jīng)水解后有18種氨基酸,氨基酸總和70.30%,賴(lài)氨酸菌體經(jīng)水解后,總賴(lài)氨酸比測(cè)定游離賴(lài)氨酸高0.11%,比其它氨基酸高0.66%。各種氨基酸高效液相色譜見(jiàn)圖2。3討論3.1氨基酸的測(cè)定方法(1)從測(cè)定氨基酸的種類(lèi)來(lái)看,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用茚三酮比色方法只能測(cè)定賴(lài)氨酸的含量;用氨基酸分析儀分析氨基酸,常見(jiàn)的18種氨基酸都可以測(cè)定,只不過(guò)測(cè)定時(shí),有不同的樣品處理方法。目前,茚三酮法只能測(cè)定賴(lài)氨酸含量,不能對(duì)其他氨基酸進(jìn)行測(cè)定。隨著對(duì)65%賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品質(zhì)量要求的精細(xì)化,提供樣品中其他氨基酸的量是發(fā)展的必然趨勢(shì)。雖然也有其他的方法測(cè)定總氨基酸,用總氨基酸減去賴(lài)氨酸的量,得出其它氨基酸的量,但使用的是兩種化學(xué)分析法,數(shù)據(jù)之間存在方法誤差,影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。所以選擇氨基酸分析儀進(jìn)行樣品分析,檢測(cè)賴(lài)氨酸和其他氨基酸的含量。(2)從樣品標(biāo)準(zhǔn)濃度和樣品稀釋倍數(shù)來(lái)看,由于樣品中賴(lài)氨酸含量很高,試樣水解液要高倍稀釋。用茚三酮比色方法測(cè)定需將樣品稀釋2000倍,使最終賴(lài)氨酸標(biāo)準(zhǔn)濃度在0.02%-0.05%,而采用氨基酸自動(dòng)分析儀方法測(cè)定時(shí)需將樣品稀釋35000倍,使最終賴(lài)氨酸標(biāo)準(zhǔn)濃度在0.0015%。由于氨基酸分析儀的稀釋倍數(shù)較大,即使樣品間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小,但仍有可能在乘以稀釋倍數(shù)后,帶入的誤差會(huì)比茚三酮方法大。為了減少操作誤差,本實(shí)驗(yàn)在量方法上采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法相結(jié)合,以最大限度除測(cè)定過(guò)程中隨機(jī)因素的影響。(3)從L-賴(lài)氨酸硫酸鹽樣品測(cè)定數(shù)據(jù)的比較來(lái)看,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,不同的樣品,不同的檢測(cè)部門(mén),不同的檢測(cè)方法,因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線范圍、蒸煮時(shí)間、補(bǔ)加蒸餾水的體積不一樣,檢測(cè)結(jié)果不一致,這是方法誤差,和試劑、儀器、操作過(guò)程有關(guān)(見(jiàn)表5)。用氨基酸分析儀測(cè)定結(jié)果較茚三酮方法時(shí)高時(shí)低,這與樣品的稀釋倍數(shù)較大有很大的關(guān)系。3.2l-硫酸鹽酸鹽產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品質(zhì)量情況不同廠家生產(chǎn)的L-賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品中L-賴(lài)氨酸含量的內(nèi)涵不同,因此應(yīng)針對(duì)具體產(chǎn)品,根據(jù)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)使用或引用的方法標(biāo)準(zhǔn),對(duì)L-賴(lài)氨酸總量和游離L-賴(lài)氨酸含量進(jìn)行分析。目前,L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行的是農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY39-1987,原GB8245-1987),但關(guān)于L-賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品還沒(méi)有國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)頒布,目前主要執(zhí)行的是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)在生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的廠家有:中糧生化、長(zhǎng)春大成、聊城希捷、金玉米、伊品等公司。各公司制定的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)如表6。3.2.1不同的氨基酸計(jì)不同廠家產(chǎn)品中L-賴(lài)氨酸含量的內(nèi)涵不同:有的以游離賴(lài)氨酸計(jì),有的以總賴(lài)氨酸計(jì)。含量表示方法也不同,有的以干基計(jì),有的以濕基計(jì)。L-賴(lài)氨酸硫酸鹽中有賴(lài)氨酸菌體,賴(lài)氨酸菌體蛋白經(jīng)過(guò)水解,有多種氨基酸生成。3.2.2樣品處理方法企業(yè)一般采用GB/T18246-2000,在這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中,有三種樣品的處理方法:酸水解法、堿水解法、酸提取法。應(yīng)結(jié)合L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的性質(zhì)、用途和需求,選擇一個(gè)合適的處理方法。3.2.3樣液的前處理和預(yù)處理目前,我們公司使用茚三酮比色法,包頭也使用茚三酮比色法。包頭方法中使用的試劑與我們的一致,但標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍、樣液的煮沸時(shí)間、補(bǔ)充蒸餾水的量與我們不同。金玉米公司、大成公司、希捷公司采用氨基酸分析儀進(jìn)行分析,從所查資料了解,樣品的前處理方法不一樣。因?yàn)長(zhǎng)-賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品不是單一化合物,它包括了賴(lài)氨酸硫酸鹽及其它發(fā)酵副產(chǎn)物,所以不能用常規(guī)滴定的方法進(jìn)行簡(jiǎn)單測(cè)定。4產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)兩種檢測(cè)方法的對(duì)比研究,實(shí)驗(yàn)選用的全自動(dòng)氨基酸分析儀方法,檢測(cè)L-賴(lài)氨酸硫酸鹽中的各種氨基酸含量,檢測(cè)方法更準(zhǔn)確,氨基酸測(cè)量更全面,更能全面反映樣品中L-賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)