氫溴酸高烏甲素在大鼠胃腸道的吸收動力學(xué)研究

氫溴酸高烏甲素在大鼠胃腸道的吸收動力學(xué)研究

氨基高吳甲素（也稱為黃酮堿，谷氨酸lh）是毛護(hù)科高吳甲素植物的高刺激性生物。它是國內(nèi)首創(chuàng)的非成毒性鎮(zhèn)痛藥物，用于治療上述疼痛。本品具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用,與哌替啶相比鎮(zhèn)痛效果相當(dāng),起效時間稍慢,而維持時間較長;鎮(zhèn)痛作用為解熱鎮(zhèn)痛藥氨基比林的7倍。毒理學(xué)本品動物實驗無致畸胎作用。氫溴酸高烏甲素具有顯著的抗炎消腫、降溫解熱與局部麻醉作用。臨床上高烏甲素主要用于癌癥疼痛的治療以及術(shù)后鎮(zhèn)痛。本研究組在氫溴酸高烏甲素口服片劑的藥動學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)該藥口服給藥生物利用度較低,因此研究該藥在胃腸道各段的吸收部位特異性以及機(jī)理對于設(shè)計口服制劑以提高其生物利用度具有重要意義。本實驗采用大鼠在體腸灌流的試驗方法,考察氫溴酸高烏甲素在胃、小腸、結(jié)腸的吸收,了解該藥在胃腸道的吸收特征,并考察了不同吸收促進(jìn)劑對其吸收的促進(jìn)效果及毒性,此外,還考察了P-糖蛋白抑制劑對藥物小腸吸收的影響,為提高其口服生物利用度和開發(fā)口服制劑提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。材料表面1試劑及試劑用量氫溴酸高烏甲素(蘭州制藥廠產(chǎn)品,批號:20060602,HPLC純度為97.2%);鹽酸維拉帕米(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。烏拉坦(上海中秦化學(xué)試劑有限公司);甲醇(色譜純,山東禹王實業(yè)有限公司);十二烷基硫酸鈉(進(jìn)口分裝);去氧膽酸鈉(上海中秦化學(xué)試劑有限公司);癸酸鈉(進(jìn)口分裝);水為純凈水,其他試劑均為分析純。Krebs-Ringer試劑(pH7.4,簡稱K-R試液)的配制:稱取氯化鈉7.8g,氯化鉀0.35g,氯化鈣0.37g,碳酸氫鈉1.37g,磷酸二氫鈉0.32g,氯化鎂0.02g,葡萄糖1.4g,加純水定容至1000mL,即得。人工胃液:按《中華人民共和國藥典》2005年版二部附錄配制。2長紫外過濾器Shimadzu高效液相色譜儀(包括SCL10Atvp系統(tǒng)控制器,SPDM10Avp可調(diào)波長紫外檢測器,LC10Atvp輸液泵,DGU12A脫氣機(jī),725I型手動進(jìn)樣閥,CTO10ASvp柱溫箱,日本島津公司);全自動電子分析天平(北京賽多利斯儀器系列有限公司);DDBT320型電子蠕動泵(上海之信儀器有限公司);UV1700紫外分光光度計(日本島津公司)。3實驗動物雄性SD大鼠,體重300g左右,購自蘭州大學(xué)動物實驗中心,許可證號:SCXK(甘)20050007。方法1試驗溶液中氫溴酸高烏甲基素濃度的測定1.1高烏甲素對供試液、小鼠和胃吸收的干擾色譜柱:YMCPACKODS-A柱(150mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇-0.1mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(50∶50),流速:0.8mL·min-1;檢測波長:252nm;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20μL。取氫溴酸高烏甲素對照液及小腸和胃吸收供試液分別經(jīng)0.22μm微孔濾膜,棄去初濾液,取續(xù)濾液20μL進(jìn)樣,在上述色譜條件下測定。色譜圖見圖1。由圖1可見供試液與氫溴酸高烏甲素對照液的峰保留時間一致,空白液在此條件下無干擾。該法最低檢測限為0.1μg·mL-1。1.2氫溴酸高烏甲基素濃度在腸道循環(huán)溶液中的測定1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取氫溴酸高烏甲素儲備液(1g·L-1)0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.4mL用K-R緩沖液定容至10mL,配成系列濃度的氫溴酸高烏甲素標(biāo)準(zhǔn)溶液,于0.22μm微孔濾膜過濾后,在上述色譜條件下進(jìn)樣20μL,以濃度(C)為橫坐標(biāo),以峰面積(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.2回收率與所需資源量試驗精密吸取氫溴酸高烏甲素儲備液適量,用空白循環(huán)溶液稀釋配制得5.0,20.0,40.0mg·L-1的3種不同濃度氫溴酸高烏甲素供試品溶液,進(jìn)樣20μL,在上述色譜條件下測定,記錄色譜圖與峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。以測得濃度與實際濃度之比計算回收率。將上述配制的氫溴酸高烏甲素低、中、高3種濃度(5.0,20.0,40.0mg·L-1)的對照品溶液,按樣品測定方法測定。以1d內(nèi)測定的3次結(jié)果,計算日內(nèi)精密度,3d內(nèi)測定的3次結(jié)果計算日間精密度。1.3胃溶液中氫溴酸高烏甲基素濃度的測定1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取氫溴酸高烏甲素儲備液適量,用人工胃液稀釋為所需系列標(biāo)準(zhǔn)液,0.22μm微孔濾膜過濾,精密吸取20μL進(jìn)樣分析,在上述色譜條件下測定,以峰面積(A)為縱坐標(biāo),以濃度(C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.2回收率試驗精密吸取氫溴酸高烏甲素儲備液適量,用空白循環(huán)溶液稀釋配制得5.0,20.0,50.0mg·L-1的3種不同濃度氫溴酸高烏甲素供試品溶液,進(jìn)樣20μL,在上述色譜條件下測定,記錄色譜圖與峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。以測得濃度與實際濃度之比計算回收率。將上述配制的氫溴酸高烏甲素低、中、高3種濃度(5.0,20.0,50.0mg·L-1)的對照品溶液,按樣品測定方法測定。以1d內(nèi)測定的3次結(jié)果計算日內(nèi)精密度,3d內(nèi)測定的3次結(jié)果計算日間精密度。2藥物初始濃度和終濃度的計算選實驗前禁食一夜(自由飲水)的大鼠,用20%烏拉坦腹腔注射麻醉(200mg·kg-1)麻醉大鼠,切開腹部,暴露胃,將賁門結(jié)扎,用玻璃插管插入幽門結(jié)扎之,用人工胃液將胃腔洗凈,注射器內(nèi)吸取胃試液10mL,注射4～5mL到胃內(nèi),然后又抽回到注射器重復(fù)幾次,使混合均勻,最后全部抽入注射器中,最后將4mL上述混合均勻的藥液注入胃內(nèi),注射器內(nèi)留下的藥液濃度為藥物初始濃度(C0),2h后從胃抽出藥液的濃度為藥物終濃度(Ct),根據(jù)氫溴酸高烏甲素初始濃度和終濃度計算其吸收率。3k-r樣品的制備將實驗前禁食18h的大鼠稱重后,用20%烏拉坦腹腔注射麻醉(200mg·kg-1)麻醉大鼠,麻醉后將大鼠背位固定于手術(shù)臺板上,用白熾燈加熱保持37℃體溫,沿腹部正中線切開腹部(約3cm)。對需要考察的部位,在兩端剪切后插管,結(jié)扎,先用少量37℃的生理鹽水沖洗腸段,再用空氣將生理鹽水排凈。取供試液(預(yù)熱至37℃)100mL(記為V0),以2.5mL·min-1的流速循環(huán)10min后開始計時,分別于回流0.25,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0h取樣0.3mL,同時補充等量的等溫K-R溶液。樣品經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,高效液相色譜法測定灌流液中藥物的濃度。實驗結(jié)束后,用空氣排出腸道內(nèi)殘留的藥液,測量灌流液的體積計為Vt。3.1藥物吸收百分率測定實驗結(jié)束后,小腸灌流液的體積有明顯的減少,為了準(zhǔn)確地計算吸收速率常數(shù),通過校正灌流液的體積便可以更準(zhǔn)確的計算得濃度。有文獻(xiàn)報道水分在腸道內(nèi)的吸收可以被描述為近似的零級動力學(xué)過程。待測溶液的初始體積(V0)是確定的,試驗結(jié)束后分別測定每只大鼠灌流液的末體積(Vt)。根據(jù)灌流液的初末體積計算出每個取樣點供試液的體積,根據(jù)每個時間點藥物濃度和供試液體積計算出腸循環(huán)液中的剩余藥量Xr,以lnXr對取樣時間作圖得一直線,由直線的斜率求出吸收速率常數(shù)(Ka);由4h剩余藥量的變化值對初始藥量的比求出4h藥物吸收百分率。lnXr=lnX0-Ka×t吸收百分率/%=(V0C0-VtCt)/V0C0×1003.2藥物在各個腸段吸收速率的測定將濃度為20mg·L-1的氫溴酸高烏甲素供試液100mL,按上述方法操作,進(jìn)行大鼠十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸循環(huán)實驗,4h后考察藥物在各個腸段的吸收狀況。計算吸收速率并進(jìn)行t檢驗。分段考察的各腸段區(qū)間如下:十二指腸段自幽門1cm處開始往下10cm止;空腸段自幽門15cm起往下10m止;回腸段自盲腸上行20cm開始往下10cm止;結(jié)腸段從盲腸后端開始往下10cm止。整腸段考察自十二指腸上端起到回腸下端止。3.3藥物濃度對腸吸收的影響用K-R溶液將藥物配制成濃度為10,20,40mg·L-1的供試品溶液,沿整腸段回流4h,依照“3”項下進(jìn)行操作,考察藥物濃度對腸吸收的影響。3.4p-糖蛋白抑制劑對藥物小鼠吸收的影響用K-R溶液將藥物配制成濃度為20mg·L-1的供試品溶液,加入100μmol·L-1的鹽酸維拉帕米作為P-糖蛋白抑制劑,沿整腸段回流4h,依照“3”項下進(jìn)行操作,考察P-糖蛋白抑制劑對藥物小腸吸收的影響。3.5灌流液中藥物濃度對藥物吸收的影響將十二烷基硫酸鈉(SDS),去氧膽酸鈉(SDC),癸酸鈉(SC)作為吸收促進(jìn)劑分別加入灌流液,使其在灌流液中的濃度達(dá)到0.2%(0.2g/100mL),藥物濃度均為20mg·L-1,沿整腸段灌流4h,測定藥物的吸收狀況。實驗完畢后,取下實驗?zāi)c段,用K氏液沖洗后,4%的甲醛固定,垂直切片,用蘇木紫-曙紅染色后,電子顯微鏡觀察。4試驗液的穩(wěn)定性測定同上述方法操作,用K氏液在循環(huán)裝置中灌流4h,得空白腸循環(huán)液,以此空白腸循環(huán)液配制含氫溴酸高烏甲素20mg·L-1小腸循環(huán)液,置(37±0.5)℃水浴中孵育,分別于0,1,2,3,4h取樣,測定峰面積。結(jié)果顯示,4h測得供試液中LH的平均含量為0時刻的(100±1.52)%,說明4h內(nèi)氫溴酸高烏甲素在腸循環(huán)液中穩(wěn)定。為考察胃吸收過程中藥物的穩(wěn)定性,以人工胃液配制含氫溴酸高烏甲素20mg·L-1的供試液,置(37±0.5)℃水浴中孵育,分別于0,0.5,1,1.5,2h取樣,測定峰面積。結(jié)果表明2h內(nèi)氫溴酸高烏甲素在胃灌注液中穩(wěn)定,RSD為0.98%。結(jié)果1回收率及精密度人工胃液中氫溴酸高烏甲素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=20701C-165.8(r=0.9997),結(jié)果表明,氫溴酸高烏甲素在5～50mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。高(50.0mg·L-1)、中(20.0mg·L-1)、低(5.0mg·L-1)濃度的平均回收率分別為97.78%,100.59%,100.78%(n=3);日內(nèi)精密度為0.41%,0.15%,0.02%(n=3);日間精密度為1.80%,1.40%,0.76%(n=3)。2回收率、精密度與定量限K-R緩沖液中氫溴酸高烏甲素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=22660C+280.27(r=0.9998),結(jié)果表明,氫溴酸高烏甲素在5～40mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好。高(40.0mg·L-1)、中(20.0mg·L-1)、低(5.0mg·L-1)濃度的平均回收率分別為99.88%,98.26%,98.24%(n=3);日內(nèi)精密度為0.50%,0.36%,0.21%(n=3);日間精密度為2.63%,1.85%,1.53%(n=3)。3物吸收百分率測定大鼠在體胃吸收實驗2h后,求出藥物吸收百分率。由表1可見,氫溴酸高烏甲素在大鼠胃中2h僅吸收9.67%,胃部為該藥物吸收的不良部位。4藥物在腸道的吸收4.1不同腸段氫溴酸高烏甲素吸收部位的檢測氫溴酸高烏甲素溶液在各腸段的吸收速率常數(shù)(Ka)和吸收百分率(%)見表2。十二指腸是氫溴酸高烏甲素較佳的吸收部位,與其他腸段比較均有顯著性差異(P<0.05);而空腸與回腸之間無顯著性差異(P>0.05),它們的吸收速率相近,結(jié)腸吸收最差。4.2循環(huán)前后的吸收量和吸收速率和速率常數(shù)高中低3個濃度的供試品溶液,沿整腸段回流4h后,求出不同濃度藥物循環(huán)后的吸收量和吸收速率常數(shù),結(jié)果見表3。結(jié)果表明,在10～40mg·L-1內(nèi)藥物的吸收量與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),沒有飽和吸收現(xiàn)象,并且吸收速率常數(shù)幾乎保持不變,初步判斷其吸收有可能是被動擴(kuò)散的結(jié)果。4.3p-糖蛋白抑制劑對段小鼠吸收速率的影響小腸灌流液中加入P-糖蛋白抑制劑后,氫溴酸高烏甲素溶液在整段小腸內(nèi)的吸收速率常數(shù)(Ka)和吸收百分率(%)見表4,結(jié)果表明,P-糖蛋白抑制劑組增加了藥物的小腸吸收,原藥組和P-糖蛋白抑制劑組的吸收百分率具有顯著性差異(P<0.05)。4.4對藥物的吸收與中濃度藥物在大鼠小腸內(nèi)吸收的實驗結(jié)果相比,吸收促進(jìn)劑十二烷基硫酸鈉、膽酸鈉和癸酸鈉對藥物在小腸內(nèi)的吸收具有明顯的促進(jìn)作用(P<0.01)。三者促進(jìn)藥物吸收的倍數(shù)分別是1.29,1.31,1.53倍。結(jié)果見表5。4.5組織病理學(xué)檢測吸收促進(jìn)劑對小腸黏膜毒性較大,為了評價本實驗中用到的促透劑毒性大小,將實驗?zāi)c段進(jìn)行常規(guī)處理后,進(jìn)行組織病理學(xué)評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn),十二烷基硫酸鈉和去氧膽酸鈉對小腸黏膜造成了不同程度的改變,如小腸絨毛脫落和倒伏,小腸上皮細(xì)胞脫落,炎性細(xì)胞增加。相比之下,癸酸鈉對小腸黏膜造成的毒性最小,結(jié)果見圖2。優(yōu)化藥物生物利用度在體小腸吸收實驗中,由于腸道吸收水分導(dǎo)致灌流液體積減少,因此,進(jìn)行藥物吸收動力學(xué)的研究時為了標(biāo)示灌流液體積變化,國內(nèi)常采用酚紅作為標(biāo)記物。一般的腸吸收理論中認(rèn)為:酚紅為一離子型化合物,在小腸內(nèi)不吸收。但有文獻(xiàn)報道酚紅可以從小腸吸收,平均吸收速率約6%,1.0mmol·L-1酚紅(pH6.5磷酸緩沖液)能從小腸吸收,并在1h血藥濃度達(dá)峰值3nmol·mL-1,因此不能用酚紅來標(biāo)示在體小腸吸收模型中灌流液的體積變化,否則將導(dǎo)致藥物吸收速率偏小,尤其是難吸收藥物,有時將得出錯誤的結(jié)論。本研究的創(chuàng)新之處在于采用了與以往文獻(xiàn)所報道的不同的方法,用體積法校正水分的吸收,此方法較簡單,且得出的結(jié)果更為準(zhǔn)確。十二指腸為氫溴酸高烏甲素的最佳吸收部位,提示可應(yīng)用制劑學(xué)方法控制氫溴酸高烏甲素在十二指腸的滯留時間,以提高其吸收程度,從而提高其生物利用度。本研究還得出P-糖蛋白抑制劑維拉帕米可增加藥物從小腸的吸收,因此在臨