液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶中4種代謝產(chǎn)物多殘留

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶中4種代謝產(chǎn)物多殘留

1cs殘留檢測方法四環(huán)素（ts）是一種廣泛用于預(yù)防和治療家禽疾病的藥物。但由于該類藥物的使用不合理及濫用,容易誘導(dǎo)耐藥菌株和導(dǎo)致在食品及牛奶中四環(huán)素類藥物的殘留問題。歐盟及我國均規(guī)定牛奶中四環(huán)素類抗生素的最大殘留限量為0.1mg/kg。常用的TCs有:四環(huán)素(tetracycline,TC)、金霉素(chlortetracycline,CTC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、強力霉素(doxycycline,DC)、去甲基金霉素(demeclocycline,DMCTC)、甲烯土霉素(methacycline,MTC)和二甲胺四環(huán)素(minocycline,MINO)等。另外,四環(huán)素、金霉素和土霉素還可在動物體內(nèi)經(jīng)代謝而轉(zhuǎn)化為差向四環(huán)素(4-Epitetracycline,ETC)、差向金霉素(4-epichlortetracycline,ECTC)和差向土霉素(4-epioxytetracycline,EOTC),差向四環(huán)素類藥物的藥效極低或消失,但它們的毒副作用增加,已經(jīng)被歐盟確定為四環(huán)素、金霉素和土霉素的殘留標(biāo)識物。目前,TCs殘留的測定方法主要有微生物法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法和液相色譜法,但這些方法存在特異性差的缺點。液質(zhì)聯(lián)用法由于具有特異性強和靈敏度高的特點,可用于四環(huán)素類抗生素殘留的確證分析。但當(dāng)前國內(nèi)外對四環(huán)素類多殘留的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的報道較少,未見關(guān)于同時檢測四環(huán)素類抗生素及其代謝產(chǎn)物殘留的文獻(xiàn)報道。而國外已開始四環(huán)素類抗生素代謝產(chǎn)物殘留檢測方法的研究。本研究建立了牛奶樣品中10種四環(huán)素類多殘留的高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜確證方法,填補了國內(nèi)外的技術(shù)空白,可為牛奶樣品中四環(huán)素類藥物及其代謝產(chǎn)物殘留的監(jiān)督檢驗和殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持。2實驗部分2.1分析試劑的制備API3000型串聯(lián)質(zhì)譜儀,配Agilent1100型高效液相色譜儀和電噴霧離子源;MinishakerMS1型旋渦混合器;UNIVERSAL32R型低溫離心機;ZYMARKLV型吹氮濃縮儀;固相萃取真空裝置(Agilent公司產(chǎn)),20孔;伏特pH510型pH計;Oasis?HLB固相萃取柱等。二甲胺四環(huán)素鹽酸鹽(Sigma公司,純度91%)、土霉素.2H2O(Sigma公司,純度99%)、四環(huán)素(Sigma公司,純度95%)、去甲基金霉素鹽酸鹽(Fluka公司,純度99%)、金霉素鹽酸鹽(Sigma公司,純度80%)、甲烯土霉素鹽酸鹽(Riedel-deHaen公司,純度99.4%)和強力霉素鹽酸鹽(Fluka公司,純度98%)、差向四環(huán)素(Acros公司,純度100%)、差向土霉素(Acros公司,純度97%)、差向金霉素(Acros公司,純度97%);甲醇、乙腈和三氟乙酸為色譜純試劑;其它試劑均為分析純試劑;水為高純水。0.1mol/LEDTA-Mcllvaine緩沖溶液:稱取檸檬酸(含1個結(jié)晶水)12.9g,Na2HPO410.9g,EDTA-Na237.2g,用高純水溶解并定容至1L,調(diào)節(jié)pH值至4.0±0.05。牛奶為市購。2.2儀器條件2.2.1進(jìn)樣量及進(jìn)樣量色譜柱:InertsilC8-3,5μm,150mm×2.1mmi.d.;流速:0.3mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:30μL。流動相:甲醇(A)-0.01mol/L三氟乙酸(B),洗脫梯度為:0min(5.0%A)→5.0min(30.0%A)→10.0min(33.5%A)→12.0min(65.0%A)→17.5min(65.0%A)→18.0min(5.0%A)→25.0min(5.0%A),共25min。2.2.2噴霧電壓is離子化模式:ESI+;質(zhì)譜分辨率:單位分辨率;霧化氣(NEB):6.0L/min;氣簾氣(CUR):10.0L/min;噴霧電壓(IS):4500V;去溶劑溫度(TEM)500℃;去溶劑氣流700L/min;碰撞氣(CAD)6.0L/min(N2)。其它條件見表1。2.3聲-質(zhì)-固相萃取液的制備稱取混勻試樣5g(精確至0.01g),置于50mL比色管中,用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine緩沖溶液溶解并定容至50mL,旋渦混合1min,低溫超聲10mins,轉(zhuǎn)移至50mL聚丙烯離心管中,冷卻至4℃,以5000r/min離心10min(溫度低于15℃),過濾。準(zhǔn)確吸取10mL提取液以1滴/秒的速度過WatersOasisHLB固相萃取柱,待樣液完全流出后,依次用5mL水和5mL甲醇-水(5∶95,V/V)淋洗,棄去全部流出液。減壓抽干5min,最后用10mL甲醇-乙酸乙酯(10∶90,V/V)洗脫。將洗脫液吹氮濃縮至干(溫度低于40℃),用1.0mL流動相溶解殘渣,低溫超聲5min,0.45μm濾膜過濾,供高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。3結(jié)果與討論3.1流動相的優(yōu)化根據(jù)文獻(xiàn),選擇InertsilC8柱作為分離柱對10種四環(huán)素類化合物進(jìn)行分離條件優(yōu)化。電噴霧離子源的最佳流速范圍為0.2～0.4mL/min。本研究采用0.3mL/min的流速,可保持較低的柱壓,有利于色譜柱的長期使用。以甲醇-乙腈-0.01mol/L的三氟乙酸水溶液為流動相對流動相的比例和洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙腈與甲醇共同存在的條件下,土霉素、差向土霉素和四環(huán)素3個組分的重構(gòu)離子色譜峰始終存在交叉重疊,無法實現(xiàn)定量;有機相僅采用乙腈,土霉素與差向土霉素合為一個峰,無法實現(xiàn)土霉素與差向土霉素的準(zhǔn)確定性和定量;有機相僅采用甲醇,經(jīng)優(yōu)化,可實現(xiàn)土霉素與差向土霉素的色譜分離。因此,有機相僅采用甲醇,經(jīng)反復(fù)優(yōu)化,采用2.2.1所示的流動相組成和洗脫梯度可達(dá)到較好的分離效果(見圖2)。3.2子離子的確定首先采用1mg/L的四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素、去甲基金霉素、甲烯土霉素、二甲胺四環(huán)素、差向四環(huán)素、差向金霉素、差向土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以流動注射的方式在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,確定各種四環(huán)素類抗生素的分子離子,然后分別以各種四環(huán)素類抗生素的分子離子為母離子,對其子離子進(jìn)行全掃描,在本研究的質(zhì)譜條件下,各種四環(huán)素類抗生素主要產(chǎn)生表2所示的子離子。選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子為定性離子(見表1)。最后以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)正離子模式優(yōu)化去簇電壓(DP)、聚焦電壓(FP)、射入電壓(EP)、碰撞電壓(CE)、碰撞室射出電壓(CXP)、霧化氣(NEB)、氣簾氣(CUR)、碰撞氣(CAD)、噴霧電壓(IS)、離子化溫度(TEM)等質(zhì)譜參數(shù)。四環(huán)素類抗生素的優(yōu)化質(zhì)譜條件見表1。3.3差向金霉素類抗生素提取凈化條件的確定由于四環(huán)素類抗生素的代謝產(chǎn)物差向四環(huán)素、差向土霉素、差向金霉素與四環(huán)素、土霉素、金霉素的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)非常類似,因此四環(huán)素類抗生素及其代謝產(chǎn)物的提取與凈化條件可采用與四環(huán)素類抗生素完全相同的提取與凈化條件。3.4線性范圍、檢出限、測定低限逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合工作液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析,測定結(jié)果用MicrosoftExcel軟件回歸,線性范圍為:50～1200μg/kg,檢出限為0.5～10.0μg/kg,測定低限為50μg/kg?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表3(y為峰面積,x為四環(huán)素類藥物的濃度,μg/kg)。3.5精密度與回收率選用不含10種待測組分的牛奶樣品,分別加入50、100和200μg/kg3個濃度水平的10種四環(huán)素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按2.3處理樣品,分析并測定其精密度及回收率,測得平均回收率(n=10)在74.4%～101%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.8%～8.3%之間。均滿足國內(nèi)外對殘留分析的要求,表明該方法