大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭啟動子探針的構(gòu)建及表達

大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭啟動子探針的構(gòu)建及表達

合成有機磷化合物在世界上廣泛用于殺蟲劑和神經(jīng)毒性藥物。有機磷化合物對人畜等有極高的毒性,其在環(huán)境中持續(xù)和大量的施用嚴重威脅著人畜健康及生態(tài)環(huán)境。用生物原位修復技術(shù)來解決有機磷有毒物質(zhì)的污染由于其成本低廉、高效,易操作并且無二次污染而日益成為研究的熱點,應用微生物及其酶制劑進行有機磷農(nóng)藥污染的原位生物修復是一項非常有發(fā)展前景和重要意義的工作。本實驗室曾經(jīng)分離到一株鄰單胞菌M6并克隆到一個全新的甲基對硫磷水解酶基因mpd。有機磷水解酶可以高效地水解劇毒農(nóng)藥甲基對硫磷從而使其毒性下降100～200倍,國際上目前報道的產(chǎn)有機磷水解酶的微生物絕大多數(shù)為革蘭氏陰性菌,且其水解酶為胞內(nèi)酶或分泌在周質(zhì)空間,影響了酶與底物的直接接觸和反應,這不僅大大降低了其實際應用效果,也使酶的分離和純化工作比較繁瑣。最近,有眾多研究將有機磷水解酶(OPH)基因opd在大腸桿菌和惡臭假單胞菌中實現(xiàn)了細胞表面表達,還有人將血紅蛋白和opd共表達或者提高opd的拷貝數(shù),這都在一定程度上提高了OPH的表達量或者對有機磷農(nóng)藥的降解效果。另外,在實際應用中,革蘭氏陰性菌在環(huán)境中同土著微生物的競爭力較差,由于不能形成特殊的休眠結(jié)構(gòu),其活體微生物制品也很難在常溫下長時間保存,這必然增加了其保存成本?？莶菅挎邨U菌是一種傳統(tǒng)的酶制劑生產(chǎn)菌株,其細胞壁結(jié)構(gòu)簡單,不分泌內(nèi)毒素,可直接將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中,對人畜安全,是美國食品藥物管理局(FDA)和中國農(nóng)業(yè)部批準使用的安全的菌株,是分泌表達外源基因的良好的受體菌。來自于M6的mpd基因在其自身的啟動子的帶動下不能夠在芽孢桿菌中表達。本實驗室曾利用mpd基因為報告基因構(gòu)建新型啟動子探針,以大腸桿菌為克隆宿主從枯草芽孢桿菌染色體上用鳥槍法克隆到一系列強啟動子功能片段,但是尚未研究這些啟動子功能片段在枯草芽孢桿菌中的啟動強度。在本研究中,我們利用先前克隆到的強啟動子和信號肽編碼序列構(gòu)建大腸桿菌_枯草芽孢桿菌穿梭分泌表達載體并在枯草芽孢桿菌中成功地分泌表達了mpd基因,其酶活遠高于出發(fā)菌株并且可以使酶蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中?？莶菅挎邨U菌可以形成芽孢,發(fā)酵產(chǎn)品易保存,同時其環(huán)境競爭力和抗逆境能力也很強,發(fā)酵技術(shù)成熟且易于控制,這些優(yōu)點將為我們應用其降解環(huán)境中的有機磷農(nóng)藥殘留和生產(chǎn)無細胞的家用型酶制劑和解毒制劑開辟一個新的途徑并且具有廣闊的發(fā)展前景。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇和顆粒本實驗所用菌株和質(zhì)粒見表1。1.1.2酶和索引限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶和Taq酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品;引物合成和測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。1.1.3基本培訓LB培養(yǎng)基和Superrich培養(yǎng)基見參考文獻。1.2方法1.2.1提取干草芽菌總dna枯草芽孢桿菌總DNA的提取參照參考文獻進行。1.2.2感染細胞的制備大腸桿菌和枯草芽孢桿菌普通感受態(tài)細胞的制備分別參照文獻進行。1.2.3pcr擴增及純化設計合成一對引物P1(5′_CGCGGATCCATGGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCG_3′)和P2(5′_CGCAAGCTTTCATCATCACTTGGGGTTGACGACCGA_3′),以含有完整的mpd結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒pMT1為模板,擴增去除了信號肽編碼序列的成熟mpd基因片段,引物P1和P2分別在mpd基因的上下游引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(見下劃線)。PCR擴增片段經(jīng)純化回收后用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切,然后克隆到穿梭載體pNW33N的相應位點,重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α新鮮感受態(tài)細胞,在含有氯霉素25μg/mL的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒驗證片段的插入,陽性克隆即為穿梭啟動子探針pNW33N_mpd。1.2.4mpd基因穿透表達載體的構(gòu)建將克隆有枯草芽孢桿菌強啟動子片段的質(zhì)粒pMPDP3和pMPDP29用Sau3AⅠ完全酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀回收之后與經(jīng)BamHⅠ酶切并脫磷酸化的穿梭啟動子探針pNW33N_mpd進行酶連,酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂布含有甲基對硫磷100μg/mL和氯霉素25μg/mL的LB平板,挑取轉(zhuǎn)化子周圍具有黃色水解圈的克隆,即為mpd基因穿梭表達載體,分別命名為pNYTM和pNYWM。1.2.5細胞系統(tǒng)的篩選提取表達載體pNYTM和pNYWM,轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A751感受態(tài)細胞,在含有氯霉素5μg/mL的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子命名為B.subtilis1A751(pNYTM)和B.subtilis1A751(pNYWM)。1.2.6重組子的篩選用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切來自于革蘭氏陽性菌的質(zhì)粒pUB110,酶切產(chǎn)物經(jīng)0.75%的瓊脂糖凝膠電泳純化后回收含有復制酶rep基因和卡那霉素抗性基因的片段,回收片段克隆至大腸桿菌質(zhì)粒pUC19的相應位點,重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,在含有氨芐青霉素100μg/mL的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。重組載體即為大腸桿菌_枯草芽孢桿菌穿梭載體,命名為pUBC19。1.2.7穿透表達載體的構(gòu)建設計合成引物P3(5′_GCGGGATCCTTTTTTGTGACG_3′)和P4(5′_GAAAGGGTGATGGCATGCGCAACTTGACCAAG_3′)擴增ytkA基因的啟動子區(qū),引物P3在擴增片段的5′端引入BamHⅠ酶切位點;設計另外一對引物P5(5′_CTTGGTCAAGTTGCGCATGCCATCACCCTTTC_3′)和P6(5′_GCGCTGCAGCTGAGGCATG_3′)以枯草芽孢桿菌1A1的總DNA為模板,擴增其胞外中性蛋白酶nprB基因的信號肽編碼序列,引物P4在擴增片段的3′端引入PstⅠ酶切位點。用引物P7(5′_GCGCTGCAGCACCGCAGGTG_3′)和P2擴增出去除了信號肽編碼序列的mpd基因片段并在5′端引入PstⅠ酶切位點。用重疊延伸拼接法(SOE)將ytkA啟動子片段和nprB信號肽編碼序列拼接后用PstⅠ酶切并與同樣酶切的mpd基因片段酶連,酶連產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后克隆到穿梭載體pUBC19的相應位點,即為穿梭分泌表達載體,命名為pYNMK。重組載體pYNMK的詳細構(gòu)建路線見圖1。1.2.8b400細胞的誘導表達提取表達載體pYNMK,轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800感受態(tài)細胞,在含有卡那霉素20μg/mL的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子命名為B.subtilisWB800(pYNMK)。1.2.9芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化在加有甲基對硫磷250μg/mL的LB平板上用牙簽點種大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化子,置于37℃溫箱保溫,觀察是否有黃色的水解圈出現(xiàn)。MPH活力單位定義及酶活力測定方法見文獻。1.2.1發(fā)酵液中卡那霉素的添加將表達菌株接種于3mL液體Superrich培養(yǎng)基中,其中B.subtilis1A751(pNYWM)和B.subtilis1A751(pNYTM)在培養(yǎng)基中添加氯霉素5μg/mL,B.subtilisWB800(pYNMK)添加卡那霉素20μg/mL;37℃過夜培養(yǎng),次日以2.0%的接種量接種于200mL同樣的培養(yǎng)基中,37℃,250r/min,搖床振蕩培養(yǎng)。定時取樣測定發(fā)酵液在600nm處的吸光值;同時測定發(fā)酵液的MPH酶活,發(fā)酵液12000r/min離心5min后取上清檢測上清中的MPH酶活。1.2.1sds東南角和酶譜分析將出發(fā)菌株鄰單胞菌M6的培養(yǎng)液用超聲波破碎后12000r/min離心5min后取上清,同時取WB800表達菌株的發(fā)酵液上清及含有空載體pUBC19的菌株的發(fā)酵液上清進行SDS_PAGE和酶譜分析實驗。SDS_PAGE和酶譜分析方法見參考文獻。2結(jié)果與討論2.1mpd基因缺失菌株在枯草芽孢桿菌中的擴增本實驗室曾經(jīng)利用啟動子探針pUC19_mpd從枯草芽孢桿菌染色體DNA啟動子基因文庫中釣取了一系列啟動子功能片段,其中啟動子陽性克隆pMPDP3和pMPDP29中分別克隆到了ytkA和ywoF兩個功能未知基因上游的強啟動子及信號肽功能片段。但是由于pUC19_mpd為大腸桿菌載體,所以pMPDP3和pMPDP29并不能夠在枯草芽孢桿菌中復制并表達mpd基因,這就要求我們構(gòu)建穿梭表達載體來驗證上述兩個啟動子在枯草芽孢桿菌中的功能。在本研究中,我們首先用mpd基因構(gòu)建了穿梭啟動子探針pNW33N_mpd,然后從pMPDP3和pMPDP29中重新把ytkA和ywoF的啟動子釣出來,從而構(gòu)建mpd基因穿梭表達載體pNYTM和pNYWM。PCR擴增去除了信號肽編碼序列的mpd基因片段見圖2,將擴增到的mpd基因片段雙酶切后克隆到大腸桿菌_枯草芽孢桿菌穿梭載體pNW33N的相應位點,重組載體pNW33N_mpd的酶切驗證及電泳圖譜見圖2,圖譜證實mpd基因PCR片段已經(jīng)成功克隆至該載體。在載體pNW33N_mpd中,mpd基因的轉(zhuǎn)錄方向與其下游的Plac啟動子方向相對(圖3),因此mpd基因在其上游多克隆位點沒有外源啟動子插入的情況下不會表達;當有合適的啟動子元件插入到該載體的mpd基因上游的多克隆位點時,mpd基因才會得以表達,因此,它可以作為啟動子探針來克隆啟動子片段。同時,由于該探針為穿梭載體,在通過其克隆到啟動子之后不需要額外的啟動子亞克隆工作便可以直接轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌進行報告基因的表達及啟動子強度的分析。由于MPH可以水解甲基對硫磷并生成亮黃色的對硝基酚,因此我們構(gòu)建的啟動子探針可以通過觀察在選擇性平板上轉(zhuǎn)化子菌落周圍是否產(chǎn)生黃色的水解圈來方便地鑒定出攜帶啟動子功能片段的陽性克隆,同時,還可以通過測定MPH的活性來確定和比較克隆到的不同啟動子的強度。2.2桿菌的dh5將啟動子陽性克隆載體pMPDP3和pMPDP29的Sau3AⅠ酶切消化片段與經(jīng)BamHⅠ酶切的脫磷載體pNW33N_mpd酶連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取具有甲基對硫磷水解酶活性的陽性克隆。得到了兩個插入外源片段最小的陽性克隆pNYTM和pNYWM。載體pNYTM和pNYWM經(jīng)測序后證實其克隆到的啟動子片段確為pMPDP3和pMPDP29中的ytkA和ywoF的啟動子功能片段。將兩個表達載體轉(zhuǎn)化到B.subtilis1A751后得到枯草芽孢桿菌表達菌株B.subtilis1A751(pNYTM)和B.subtilis1A751(pNYWM)。2.3mpd基因是否被功能表達mpd基因的表達產(chǎn)物MPH能夠高效水解無色的甲基對硫磷并且生成亮黃色的對硝基苯酚,利用這個反應特點,可以非常容易地檢測mpd基因是否在表達菌株得到功能性表達。將隔夜培養(yǎng)的大腸桿菌和枯草桿菌表達菌株用牙簽點種在含有甲基對硫磷的LB平板上,并點種不含表達載體的菌株作為對照。點種之后培養(yǎng)一段時間,可以觀察到大腸桿菌和枯草桿菌表達菌株的菌苔周圍均有亮黃色的水解圈的產(chǎn)生(圖4),證明mpd基因在枯草桿菌啟動子和信號肽的調(diào)控下,在枯草桿菌中實現(xiàn)了活性表達。2.4mph酶活的變化枯草桿菌1A751(pNYTM)和1A751(pNYWM)在Superrich培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)的生長曲線和發(fā)酵液的MPH酶活變化曲線見圖5。從圖5中可以看出,在ytkA和ywoF基因不同的啟動子帶動下,mpd基因在枯草桿菌中的表達水平相差很大。1A751(pNYWM)表達菌株的表達水平很低,MPH酶活在對數(shù)生長期不斷升高,在穩(wěn)定期前期培養(yǎng)至第18h時酶活達到最高值0.50u/mL后便呈平緩下降的趨勢。而1A751(pNYTM)菌株的mpd基因在其對數(shù)生長期和穩(wěn)定期都能夠迅速而高效地表達,在穩(wěn)定期后期培養(yǎng)至第55h時MPH酶活達到最高值3.57u/mL,隨后酶活有明顯的下降,我們推測該酶活的下降是因為宿主菌穩(wěn)定期后期某種蛋白酶的表達造成的,有關(guān)枯草桿菌蛋白質(zhì)組學最新文獻報道枯草桿菌至少表達27種蛋白酶,而且大部分都在穩(wěn)定期表達,而1A751只敲除了2個蛋白酶基因,難免表達產(chǎn)物在穩(wěn)定期后期會有一定的降解。發(fā)酵液離心后取上清測定MPH酶活發(fā)現(xiàn),1A751(pNYTM)發(fā)酵液的上清檢測不到酶活,這應與ytkA基因的脂蛋白信號肽的特殊性有關(guān),ytkA基因的信號肽為一典型的脂蛋白信號肽,我們推測脂蛋白信號肽在和mpd基因融合表達之后,融合蛋白N_端的半胱氨酸經(jīng)過脂修飾、切除信號肽之后與原生質(zhì)膜相結(jié)合,而融合蛋白在質(zhì)膜的外側(cè)折疊后行使其功能,從而在質(zhì)膜表面嵌合形成一種疏水端_親水端的特殊的穩(wěn)定的存在形式;如果將ytkA基因的信號肽編碼序列換成分泌型蛋白的信號肽編碼序列,將有望實現(xiàn)表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中去。1A751(pNYWM)發(fā)酵液的上清酶活占發(fā)酵液總酶活的87.3%左右,這也恰好證實了我們以往對ywoF基因的信號肽為分泌型信號肽的預測。從兩個枯草芽孢桿菌表達菌株的MPH的表達水平來看,ytkA基因的啟動子強度遠遠強于ywoF基因的啟動子,而在大腸桿菌中,ywoF基因的啟動子卻強于ytkA基因的啟動子,這說明一個啟動子在大腸桿菌中是強啟動子并不一定在枯草芽孢桿菌中也是強啟動子,今后直接利用我們新構(gòu)建的穿梭啟動子探針pNW33N_mpd克隆枯草芽孢桿菌啟動子功能片段并直接在枯草芽孢桿菌宿主中比較其啟動子強度將更有意義。2.5wb400為宿主菌為了利用在枯草芽孢桿菌中較強的ytkA基因的啟動子實現(xiàn)mpd的高水平表達,使目的蛋白分泌到培養(yǎng)基中去并且最大限度地避免目的蛋白的降解,我們根據(jù)文獻報道選擇了分泌效率較高的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因nprB的信號肽來重新構(gòu)建表達載體以實現(xiàn)甲基對硫磷水解酶的高效分泌表達,并且采用了缺失了8種蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌WB800作為宿主菌。由于WB800具有氯霉素抗性,來源于pNW33N的表達載體不能夠應用于WB800。為了構(gòu)建一個可以應用于WB800菌株的穿梭載體,將陽性菌質(zhì)粒pUB110的含有卡那霉素抗性基因和復制酶基因及復制啟始位點的EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切片段克隆到大腸桿菌載體pUC19的相應位點構(gòu)建了新的穿梭載體pUBC19。ytkA基因啟動子片段和nprB基因的信號肽編碼序列的PCR擴增產(chǎn)物見圖6,2個PCR片段拼接之后與mpd基因片段連接,然后克隆到穿梭載體pUBC19的BamHⅠ/HindⅢ位點構(gòu)建了穿梭分泌表達載體pYNMK,該載體酶切驗證圖譜見圖6。穿梭分泌表達載體pYNMK轉(zhuǎn)入WB800后獲得表達菌株WB800(pYNMK)。2.6mph的表達純化及鑒定枯草芽孢桿菌WB800(pYNMK)在Superrich培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)的生長曲線和發(fā)酵液的MPH酶活變化曲線見圖7。從圖7中可以看出,在ytkA基因啟動子和NprB信號肽的帶動下,mpd基因在WB800宿主中得到了更高水平的表達。在穩(wěn)定期后期第84h時MPH酶活達到最高值為10.40u/mL,是出發(fā)菌株鄰單胞菌M6表達量(0.96u/mL)的10.8倍。穩(wěn)定期后期酶活基本保持穩(wěn)定沒有明顯的降解現(xiàn)象。檢測發(fā)酵液上清酶活發(fā)現(xiàn)有91.4%的酶活在上清液中,這表明我們利用nprB基因的信號肽成功地實現(xiàn)了MPH的跨膜分泌并且分泌到培養(yǎng)基中?？莶菅挎邨U菌WB800缺失了8種蛋白酶活性并且pUB110來源的穿梭載體pUBC19具有更高的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性,可能是以上因素使mpd基因得到了更高水平的分泌表達。WB800表達菌株的發(fā)酵液上清中重組MPH的SDS_PAGE(2～4泳道)和酶譜(5～7泳道)分析見圖8,從圖8第4泳道可以看出在表達菌株發(fā)酵液上清中出現(xiàn)一條重組表達MPH明顯的表達條帶(箭頭處);相對于原始菌株M6