從高碳醇萃取林可霉素的研究

從高碳醇萃取林可霉素的研究

林可霉素是林可鏈霉菌變異引起的抗生素。它對(duì)大多數(shù)常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌都有抗菌活性，并且抗藥性發(fā)展緩慢。對(duì)呼吸、骨骼和軟組織的感染也有良好療效。林可霉素A的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。除林可霉素A外,林可霉素產(chǎn)生菌在一定條件下還產(chǎn)生B、C、D等類(lèi)似物(表1),除了林可霉素C的抗菌活性與林可霉素A相同外,其余都較差,沒(méi)有實(shí)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)林可霉素生產(chǎn)廠家發(fā)酵產(chǎn)物以林可霉素A為主,同時(shí)也含有約10%的林可霉素B。林可霉素B抗菌活力較小,在產(chǎn)品中含量應(yīng)控制在較低水平。隨著林可霉素更多地被作為半合成抗生素的原料來(lái)使用,對(duì)于降低其中林可霉素B含量的要求也在提高。從發(fā)酵液中提取林可霉素,國(guó)內(nèi)多采用丁醇提取工藝,萃取時(shí)對(duì)林可霉素B幾乎沒(méi)有分離作用,產(chǎn)品中林可霉素B含量較高。為了提高提取收率和產(chǎn)品純度,一直在進(jìn)行更有效的新提取工藝的研究工作。高碳醇對(duì)林可霉素A有較高選擇性,以高碳醇為萃取劑,有利于降低產(chǎn)品中林可霉素B含量;高碳醇的水不溶性和高沸點(diǎn),有利于減少溶劑損失。本文以降低產(chǎn)品中林可霉素B含量為目的,研究了以混合高碳醇為溶劑的提取工藝路線(xiàn),重點(diǎn)考察了工藝中關(guān)鍵性問(wèn)題。在此基礎(chǔ)上,還驗(yàn)證了保留原丁醇提取工藝,利用混合高碳醇萃取對(duì)林可霉素產(chǎn)品進(jìn)行純化的可行性。1材料和方法1.1林可霉素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)酵濾液由抗生素生產(chǎn)廠家提供,是放罐后發(fā)酵液經(jīng)酸化后過(guò)濾所得清液,化學(xué)方法定效價(jià)其中含有10%的林可霉素B。林可霉素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品由上海市藥品檢定所提供。實(shí)驗(yàn)中所用的林可霉素丁醇提取一次結(jié)晶、二次結(jié)晶分別為林可霉素生產(chǎn)廠家丁醇提取工藝的中間產(chǎn)品和成品,其中林可霉素B的含量分別為5.2%和4.2%。1.2樣品含量測(cè)定萃取、堿洗、反萃實(shí)驗(yàn)在帶恒溫夾套的分液漏斗中進(jìn)行,恒溫25℃下操作,振蕩10min以確保達(dá)到平衡。根據(jù)所需的操作級(jí)數(shù),采用多只分液漏斗串聯(lián),模擬進(jìn)行多級(jí)逆流實(shí)驗(yàn),直到操作達(dá)到穩(wěn)定為止。反萃液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行減壓濃縮,溫度50～60℃,真空度為5.33～6.67×104Pa。林可霉素結(jié)晶在真空干燥器中50℃下烘干。林可霉素和氯化鈀在酸性條件下反應(yīng)生成有色絡(luò)合物,在380nm處有明顯吸收峰,利用此性質(zhì)采用分光光度法分析林可霉素含量(包括A和B組分)。測(cè)定發(fā)酵液效價(jià)時(shí),調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH11～12,再用正丁醇萃取,取丁醇提取液,用95%乙醇稀釋至適當(dāng)濃度后顯色分析。分析有機(jī)相中林可霉素含量時(shí),用95%乙醇稀釋至適當(dāng)濃度后進(jìn)行顯色。以林可霉素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),樣品分析結(jié)果以林可霉素A鹽酸鹽的形式來(lái)表示。產(chǎn)品中林可霉素B的含量采用HPLC分析,用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;0.05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸調(diào)pH值至6.0)∶甲醇(4:6)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。2結(jié)果與討論2.1高碳醇萃取劑最佳條件以高碳醇為萃取劑從發(fā)酵液中提取林可霉素時(shí),由于萃取劑的改變,原先以丁醇為萃取劑提取工藝的條件要發(fā)生較大變化:(1)以高碳醇為萃取劑時(shí)容易發(fā)生乳化,需采取發(fā)酵濾液絮凝處理、調(diào)節(jié)混合醇組成等措施,以解決乳化問(wèn)題;(2)高碳醇對(duì)林可霉素的萃取能力顯著小于丁醇,為保證較高的提取效率,萃取級(jí)數(shù)、相比等有較大改變,洗滌和反萃取等操作條件也有相應(yīng)變化(圖2)。2.1.1甲殼素和硫酸鋁鉀的用量對(duì)產(chǎn)酶環(huán)境質(zhì)量的影響發(fā)酵濾液在放罐后已經(jīng)進(jìn)行了草酸酸化處理,去除大量的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。由于在偏堿性條件下,高碳醇萃取時(shí)易發(fā)生乳化現(xiàn)象;為了減少高碳醇萃取時(shí)的乳化,萃取實(shí)驗(yàn)前還需對(duì)發(fā)酵濾液進(jìn)行絮凝處理,再去除部分蛋白質(zhì)等表面活性劑雜質(zhì)。調(diào)節(jié)發(fā)酵濾液pH至10.0,加入甲殼素溶液、硫酸鋁鉀[KAl(SO4)2·12H2O](用量分別為發(fā)酵液的1%和0.2%),用NaOH溶液調(diào)pH至9.0,絮凝3h;最后再加入NaOH溶液,調(diào)pH至10.0,過(guò)濾除去絮凝沉淀。絮凝過(guò)程中效價(jià)回收率為98.9%。甲殼素和硫酸鋁鉀起絮凝劑作用,使發(fā)酵液中剩余的部分蛋白質(zhì)沉淀析出,有利于改善萃取后的分相情況,減少乳化損失。實(shí)驗(yàn)中,減少甲殼素溶液(0.1%～0.5%)和硫酸鋁鉀(0.05%～0.1%)的用量,析出絮凝沉淀顯著減少;增加甲殼素(1.5%～2%)、硫酸鋁鉀的用量(0.3%～0.4%),過(guò)濾所得的絮凝沉淀量沒(méi)有進(jìn)一步增加;因此,下文的萃取實(shí)驗(yàn)中,發(fā)酵濾液按照甲殼素溶液、硫酸鋁鉀加入量分別為發(fā)酵液的1%和0.2%,進(jìn)行絮凝處理。2.1.2林可可霉素的提取(1)萃取有機(jī)相的制備表1所示為不同組成的萃取劑對(duì)林可霉素萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。水相為二次結(jié)晶林可霉素溶液,濃度4000μg/ml,pH=10,有機(jī)相由正辛醇(C8)和正癸醇(C10)以不同配比混合而成,25℃下萃取,相比VO/VA=1/3。盡管增加辛醇含量可略微增加有機(jī)相的萃取能力,但考慮到分相速度以及對(duì)林可霉素A、B組分的萃取選擇性,下文中萃取實(shí)驗(yàn)均采用80%正辛醇∶20%正癸醇的混合配比。(2)不同ph值萃取溶劑單級(jí)萃取在偏堿性條件下,林可霉素容易被從水相萃取入有機(jī)相中。以二次結(jié)晶林可霉素水溶液調(diào)節(jié)至不同pH值,用80%辛醇∶20%癸醇為溶劑進(jìn)行單級(jí)萃取,結(jié)果如圖3所示。由圖3可見(jiàn),保持較高pH值(接近10.0),對(duì)萃取操作有利。但過(guò)高的pH,不僅要消耗較多的堿,而且會(huì)加速林可霉素的分解。選取pH10為較適宜的萃取條件。(3)萃取分配比對(duì)萃取收率的影響二次結(jié)晶林可霉素水溶液調(diào)節(jié)至pH10.0,以80%辛醇∶20%癸醇為萃取劑在不同溫度下進(jìn)行單級(jí)萃取,結(jié)果如圖4所示。由圖4可見(jiàn),在較高的萃取溫度下(接近60℃),可以得到較大的萃取分配比(較常溫下高出40%～50%),對(duì)提高萃取收率有利。但過(guò)高的溫度會(huì)增加溶劑揮發(fā)損失,對(duì)操作環(huán)境污染較大。為了減少溶劑揮發(fā)損失,萃取應(yīng)在較低的溫度下進(jìn)行,同時(shí)可以適當(dāng)增加多級(jí)逆流萃取的級(jí)數(shù)來(lái)保證萃取收率。下文中多級(jí)萃取、洗滌和反萃取在25℃下進(jìn)行。(4)林可霉素在不同濃度混合醇萃取中的穩(wěn)定性對(duì)酸化后發(fā)酵濾液進(jìn)行絮凝處理,調(diào)節(jié)pH至10.0,效價(jià)為3249μg/ml,25℃下用80%辛醇∶20%癸醇進(jìn)行12級(jí)逆流萃取,相比VO/VA=1/3。模擬實(shí)驗(yàn)達(dá)到穩(wěn)態(tài)操作時(shí),各級(jí)有機(jī)相和水相中林可霉素的化學(xué)效價(jià)如圖5所示。從有機(jī)相出口濃度來(lái)計(jì)算,12級(jí)萃取的提取收率為92.8%。可見(jiàn),采用12級(jí)逆流萃取,可以保證足夠高的萃取收率。圖5中,在低濃度范圍內(nèi),D顯著減小。林可霉素濃度對(duì)萃取分配比的影響如圖6所示。取少量發(fā)酵液,稀釋至低濃度范圍(306.9μg/ml),調(diào)節(jié)pH為10.0,萃取分配比D為2.23,遠(yuǎn)高于圖5中n=12時(shí)的D=0.48。這表明,單是濃度的下降還不足以造成D的減小;經(jīng)HPLC測(cè)定,混合醇對(duì)林可霉素A和B的分離系數(shù)β相當(dāng)大,在萃取實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),β=3～7;多級(jí)逆流萃取實(shí)驗(yàn)中,發(fā)酵液中原先含有的少量極性較強(qiáng)的林可霉素B組分在稀端逐級(jí)富集,造成A、B兩組分總分配比D的下降。2.1.3萃取時(shí)間的確定堿洗目的在于除去萃取時(shí)進(jìn)入有機(jī)相中的色素、無(wú)機(jī)鹽、林可霉素B等雜質(zhì),以提高產(chǎn)品純度。堿洗后水相可與發(fā)酵液混合后再進(jìn)行萃取,而不影響產(chǎn)品收率。表2所示為不同相比下,模擬兩級(jí)逆流洗滌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,水相為pH10.0緩沖溶液,25℃下洗滌。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以下是較合適的堿洗工藝條件:以pH10緩沖液在25℃下洗滌萃后有機(jī)相,兩級(jí)逆流操作,VO/VA=2～3;堿洗后水相返回絮凝后發(fā)酵液,再進(jìn)行萃取。2.1.4固相反萃與末級(jí)反萃按化學(xué)計(jì)量比加入鹽酸,可從有機(jī)相中反萃取林可霉素,同時(shí)起到濃縮和再生溶劑的作用。由于高碳醇與水的互溶度較丁醇小得多,與原有丁醇提取工藝相比(4～6級(jí)),反萃的級(jí)數(shù)可以減少。以稀鹽酸為水相對(duì)堿洗后萃取液進(jìn)行反萃取,有機(jī)相效價(jià)為9159μg/ml,水相為pH2.0稀鹽酸。VO/VA=3,25℃下模擬3級(jí)逆流反萃。末級(jí)反萃在攪拌下進(jìn)行,用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0～2.5,實(shí)驗(yàn)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)對(duì)各級(jí)取樣分析,結(jié)果表3所示。根據(jù)以上結(jié)果,反萃取時(shí)采用2～3級(jí)逆流操作,pH調(diào)至2.0～2.5,相比VO/VA=3～5,可以保證反萃完全。2.1.5高碳醇萃取有利于減少林可霉素b含量濃縮、結(jié)晶和干燥條件參照丁醇提取工藝。反萃液減壓濃縮至(2.5～3)×105μg/ml,加入活性碳脫色,過(guò)濾。濾液中分次緩慢加入9倍體積的丙酮,在4℃下靜置充分析出晶體。過(guò)濾,固體用丙酮洗滌后,在50℃下真空干燥。干燥后樣品經(jīng)分光光度法測(cè)總效價(jià)為849μg/mg(林可霉素A鹽酸鹽分子式為C18H34N2O6S·HCl·1/2H2O,分子量為452,純品效價(jià)為899μg/mg)。用HPLC法分析,成品中林可霉素B含量為1.3%,顯著低于丁醇提取工藝二次結(jié)晶產(chǎn)品(4.2%)。這表明,由于高碳醇對(duì)極性較弱的林可霉素A有較高選擇性,利用高碳醇萃取有利于降低產(chǎn)品中林可霉素B含量;雖然丁醇對(duì)林可霉素的萃取能力較強(qiáng),但萃取選擇性較低,成品中仍有較多的林可霉素B;此外,高碳醇沸點(diǎn)較高(>200℃),不溶于水,萃取劑的揮發(fā)和溶解損失較小;而丁醇沸點(diǎn)較低(117℃),且溶于水(7.4g/100g水),萃取后從萃余相中回收溶劑,須消耗較多能量。2.2醇提取工藝進(jìn)一步加工以提高林可霉素b含量在保留原有丁醇提取工藝的前提下,由于市場(chǎng)需求,部分產(chǎn)品需要用混合醇提取工藝進(jìn)一步加工,以降低林可霉素B含量,以滿(mǎn)足市場(chǎng)上對(duì)較高純度林可霉素原料(林可霉素B含量小于2%)的要求。為此,研究了混合高碳醇和丁醇萃取工藝結(jié)合的工藝條件,初步擬定的工藝路線(xiàn)如圖6所示。2.2.1水相林協(xié)同萃取實(shí)驗(yàn)以林可霉素丁醇提取一次結(jié)晶配制成不同濃度的的溶液,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.0,以混合醇80%正辛醇∶20%正癸醇進(jìn)行單級(jí)萃取(25℃),結(jié)果如圖7所示。高濃度萃取操作時(shí),分配比D較正常濃度范圍中顯著增大;此外,高濃度負(fù)載下(CO≥3×105μg/ml)混合醇粘度很高,這給操作和工藝控制帶來(lái)困難。選擇適當(dāng)?shù)乃嗔挚擅顾貪舛?模擬多級(jí)萃取實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表5所示。可見(jiàn),萃取操作采用兩級(jí)逆流方式,相比VO/VA=0.5～1,可保證萃取收率在90%以上。2.2.2堿洗需選用的堿法為確保堿洗后有機(jī)相中林可霉素B含量足夠低和產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到要求,堿洗需采用較大相比。水相為pH10.0緩沖溶液,有機(jī)相濃度為(4～8)×104μg/ml,相比VO/VA=1,25℃下單級(jí)堿洗后,有機(jī)相中效價(jià)的保留率為82.7%～86.2%。2.2.3丁醇-丁醇萃取分離林可霉素b晶體結(jié)構(gòu)堿洗后(單級(jí)操作)有機(jī)相濃度CO=3.5～9×104μg/ml,用1mol/L鹽酸反萃,相比VO/VA=3～11。反萃后水相經(jīng)減壓濃縮,效價(jià)范圍達(dá)到(2.5～3)×105μg/ml,加入丙酮,在4℃下充分析出結(jié)晶,晶體經(jīng)過(guò)濾和用丙酮洗滌后,50℃～60℃下減壓干燥。對(duì)干燥后樣品進(jìn)行分析,化學(xué)效價(jià)為851μg/mg;用HPLC法分析,其中林可霉素B含量為1.29%～1.78%,顯著低于丁醇提取工藝一次結(jié)晶(5.2%)和二次結(jié)晶產(chǎn)品(4.2%)。在保留原有丁醇提取工藝的基礎(chǔ)上,采用混合高碳醇為萃取劑,對(duì)丁醇提取所得的林可霉素粗品進(jìn)行萃取純化,可以在原有提取設(shè)備不作較大改動(dòng)的前提下,大幅度地提高產(chǎn)品純度,經(jīng)濟(jì)效益顯著。對(duì)林可霉素B含量已經(jīng)較低的一次結(jié)晶作進(jìn)一步純化,一般需要采取兩級(jí)以上的連續(xù)逆流萃取和堿洗操作;調(diào)整萃取、堿洗和反萃操作的級(jí)數(shù)和相比等條件,可使純化后樣品滿(mǎn)足不同純度要求(林可霉素B≤1.5%或≤0.8%)。3混合高碳醇萃取工藝的應(yīng)用(1)在優(yōu)化工藝條件下,以混合高碳醇為萃取劑從發(fā)酵液中提取林可霉素,可以顯著降低產(chǎn)品中林可霉素B組份的含量,產(chǎn)品中B組分為1.3%。隨著林可霉素越來(lái)越多地用作半合成抗生素的原料,對(duì)其中B組分含量的要求也在提高。B組分含量小于4%的產(chǎn)品基本上能滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)需求,但是出口藥品中B組分含量至少應(yīng)小于2%;隨著B(niǎo)組分含量的降低,價(jià)格提高很多,市場(chǎng)上B組分含量小于1.5%的林可霉素產(chǎn)品比含4%B組分的林可霉素產(chǎn)品價(jià)格高出1倍以上。丁醇提取工藝中,萃取劑消耗較大;而對(duì)于高碳醇提取工藝,雖然萃取劑成本較高,但揮發(fā)和溶解損失小;綜合考慮萃取操作成本和因產(chǎn)品價(jià)位提高帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)收益,混合高碳醇萃取工藝有良好的應(yīng)用前景。(2)在保留原有丁醇提取工藝的同時(shí),結(jié)合混合高碳醇萃取,對(duì)丁提工藝的一次結(jié)晶產(chǎn)品(5.2%B組分)進(jìn)行提純,成品中林可霉素B含量為1.29%～1.78%。在無(wú)須對(duì)原工藝的設(shè)備進(jìn)行較大改動(dòng)的