微生物的遺傳變異和育種

第一節(jié)遺傳變異物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變和誘變育種第三節(jié)基因重組第四節(jié)基因工程第五節(jié)菌種衰退、復(fù)壯和保藏微生物的遺傳變異和育種第1頁(yè)

第一節(jié)遺傳變異物質(zhì)基礎(chǔ)

一、三個(gè)經(jīng)典試驗(yàn)

（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

F．Griffith（1928年）

肺炎雙球菌，可使人患肺炎，也可使小白鼠患敗血癥而死亡。它有各種菌株，其中含有莢膜，且菌落表面光滑（smoth）致病菌株,稱S型;另一個(gè)不形成莢膜,菌落粗糙（rough）,無(wú)致病性,稱R型。F．Griffith作了3組試驗(yàn)以下列圖微生物的遺傳變異和育種第2頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第3頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第4頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第5頁(yè)

以后，有三位科學(xué)家將第三組試驗(yàn)進(jìn)行以下改進(jìn)：從高溫滅活S型細(xì)菌中提取幾個(gè)細(xì)胞成份(如DNA、蛋白質(zhì)、莢膜多糖等)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)——Avery試驗(yàn)，如圖示：

以上試驗(yàn)說明：高溫滅活S型肺炎球菌細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)物質(zhì)，能以某種方式進(jìn)入R型細(xì)胞使其表示出莢膜性狀。其中Avery試驗(yàn)深入證實(shí)轉(zhuǎn)化因子是DNA。微生物的遺傳變異和育種第6頁(yè)（二）噬菌體感染試驗(yàn)

1952年，A.D.Hershey和M.Chase將E.coli分別培養(yǎng)在以放射性32PO43-或35SO42-作為磷源或硫源組合培養(yǎng)基中，得到兩種噬菌體:一個(gè)含32P-DNA為關(guān)鍵噬菌體，一個(gè)含35S-蛋白質(zhì)外殼噬菌體。試驗(yàn)以下圖微生物的遺傳變異和育種第7頁(yè)噬菌體感染試驗(yàn)Pr只含S不含PDNA只含P不含S原理步驟1：用含同位素Ｓ35,

P32培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌2：讓T2感染上述大腸桿菌使其打是S35P32標(biāo)識(shí)3：吸附10分鐘后攪動(dòng)離心上清液沉淀結(jié)果：上清液中含15%放射擊性；沉淀中含85%放射性微生物的遺傳變異和育種第8頁(yè)（三）植物病毒重建試驗(yàn)

煙草花葉病毒（TMV）是一個(gè)只含RNA植物病毒，其中94%是蛋白質(zhì)外殼，6%是RNA?？稍跓煵萆弦l(fā)病斑。把TMV放在水和苯酚中震蕩，可將病毒蛋白質(zhì)外殼和RNA分開，分開蛋白質(zhì)外殼和RNA分子又能重新組合成含有感染力完整病毒粒子。另一株與TMV近緣霍氏車前花葉病毒（HRV），也可引發(fā)病斑。但兩種病斑表征不一樣。1956年，F(xiàn)raenkel-conrat利用這兩株植物病毒核酸和蛋白質(zhì)拆、合及相互對(duì)換進(jìn)行試驗(yàn)以下列圖。微生物的遺傳變異和育種第9頁(yè)植物病毒重建試驗(yàn)TMVHRVHRVTMV原始株拆開重建感染分離純化

微生物的遺傳變異和育種第10頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第11頁(yè)（一）七個(gè)水平細(xì)胞水平細(xì)胞核水平染色體水平核酸水平基因水平密碼子水平核苷酸水平二、遺傳物質(zhì)存在部位和方式微生物的遺傳變異和育種第12頁(yè)質(zhì)粒：凡游離于原核生物核基因組以外，含有獨(dú)立復(fù)制能力小型共價(jià)閉合環(huán)狀dsDNA分子。質(zhì)粒特點(diǎn)：從結(jié)構(gòu)上看為超螺旋結(jié)構(gòu)從大小上看，相對(duì)分子質(zhì)量為106～108（相當(dāng)核基因組1％）從功效上看，質(zhì)粒上存在核內(nèi)沒有基因，賦予了原核生物并非必不可少特殊功效，如：產(chǎn)毒、接合、抗藥、固氮等。從存在形式上看，是一個(gè)復(fù)制子，分為嚴(yán)緊型復(fù)制（與核染色體復(fù)制同時(shí)）與松弛型復(fù)制（不與核染色體復(fù)制同時(shí)）。（二）原核生物質(zhì)粒微生物的遺傳變異和育種第13頁(yè)少許質(zhì)?？稍诓灰粯泳觊g轉(zhuǎn)移，如：F因子或R因子等。有些質(zhì)粒含有與核染色體發(fā)生整合或脫離功效，稱附加體.如F因子。另外，質(zhì)粒還有基因重組功效，可在質(zhì)粒間、質(zhì)粒與核染色體之間發(fā)生基因重組。一些有代表性質(zhì)粒：F因子、R因子、Col質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒、巨大質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒。微生物的遺傳變異和育種第14頁(yè)F因子：又稱性因子，是E.coli等細(xì)菌決定性別質(zhì)粒，當(dāng)然除E.coli外，亦發(fā)覺其它菌也有此質(zhì)粒。如假單胞菌屬、鏈球菌屬。有性菌毛細(xì)菌體內(nèi)均含性質(zhì)粒，且性菌毛根數(shù)與性質(zhì)粒數(shù)目相等（1-4），故屬于松弛型。R因子：亦稱抗藥質(zhì)粒、R質(zhì)粒存在于細(xì)菌中，使菌體含有抗藥性質(zhì)粒。最初是在痢疾桿菌中提取出來。Col質(zhì)粒：又稱大腸桿菌素質(zhì)粒，許多細(xì)菌都能產(chǎn)生使其它原核生物抑制或致死蛋白質(zhì)類細(xì)菌毒素。大腸桿菌素都是由Col質(zhì)粒編碼。微生物的遺傳變異和育種第15頁(yè)Ti質(zhì)粒：亦稱誘癌質(zhì)粒主要存在于根癌菌株中，由Ti質(zhì)粒引發(fā)植物根癌。巨大質(zhì)粒：比普通質(zhì)粒大幾十倍至幾百倍。其它質(zhì)粒：降解性質(zhì)粒只存在于假單胞菌屬，能夠編碼可降解復(fù)雜物質(zhì)酶類。返回目錄微生物的遺傳變異和育種第16頁(yè)幾個(gè)主要概念：基因突變：簡(jiǎn)稱突變，是遺傳物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生可遺傳性改變，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。野生型菌株：從自然界分離到菌株，簡(jiǎn)稱野生型。突變株：即野生型經(jīng)突變后形成帶有新性狀菌株。

第二節(jié)基因突變和誘變育種微生物的遺傳變異和育種第17頁(yè)一、基因突變（一）突變類型依據(jù)突變菌株能否在選擇性培養(yǎng)基上加以判別，可分為：選擇性突變和非選擇性突變兩大類。前者在選擇性培養(yǎng)基上經(jīng)過表型就能夠區(qū)分開，主要有：營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型、抗性突變型、條件致死突變型；后者在選擇培養(yǎng)基上不能用表型區(qū)分開，主要有：形態(tài)突變型、抗原突變型、產(chǎn)量突變型。微生物的遺傳變異和育種第18頁(yè)——選擇性突變營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型：因?yàn)橐吧突虬l(fā)生突變，而喪失了合成某一個(gè)或某幾個(gè)生長(zhǎng)因子、堿基或氨基酸能力，無(wú)法在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這類菌株稱為營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型?？剐酝蛔冃停阂?yàn)榛蛲蛔?，野生型菌株產(chǎn)生了對(duì)某種理化因子抗性突變類型。如一些抗生素抗藥性菌株。條件致死突變型：菌株在基因突變后，在一定條件下可正常地生長(zhǎng)、繁殖并展現(xiàn)其固有表型，而在另一條件下卻無(wú)法生長(zhǎng)、繁殖，這類突變類型稱為條件致死突變型。比如：一些T4噬菌體突變株在25℃下可感染其宿主E.coli，而至37℃時(shí)卻不能感染。微生物的遺傳變異和育種第19頁(yè)——非選擇性突變形態(tài)突變型：指?jìng)€(gè)體形態(tài)或群體形態(tài)因突變而與野生型不一樣。比如：S形菌落突變?yōu)镽形菌落，鞭毛有沒有或莢膜有沒有突變?？乖蛔冃停阂?yàn)橥蛔兪箍乖Y(jié)構(gòu)與野生型不一樣。如：細(xì)胞壁缺點(diǎn)變異（如L型細(xì)菌）。產(chǎn)量突變型：經(jīng)過基因突變而取得在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上顯著有別于原始菌株突變株。若產(chǎn)量顯著高于原始菌株者稱正突變，反之則稱負(fù)突變。微生物的遺傳變異和育種第20頁(yè)突變率：某一細(xì)胞（或病毒粒子）在某一世代中發(fā)生某一性狀突變幾率。如突變率為10-8表示細(xì)胞在1億次分裂過程中，會(huì)發(fā)生1次突變。突變是獨(dú)立發(fā)生，相互不影響，同一細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)或兩個(gè)以上突變幾率極低。雙重或多重突變幾率是各個(gè)基因突變幾率乘積。（二）突變率微生物的遺傳變異和育種第21頁(yè)自發(fā)性：是在沒有些人為干涉條件下產(chǎn)生突。不對(duì)應(yīng)性：指突變性狀與引發(fā)突變?cè)蛑g無(wú)直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。稀有性：普通突變尤其是自發(fā)突變，幾率極?。◣茁蕿?0-6-10-9）。獨(dú)立性：某基因突變率不受它種基因突變率影響?？烧T變性：使用誘變劑，可顯著提升突變幾率，在遺傳育種上較慣用。穩(wěn)定性：突變后新性狀能夠穩(wěn)定地遺傳給下一代?？赡嫘裕河梢吧突蜃儺悶橥蛔冃突?，稱正向變異。由突變型基因返回到原始野生型基因，稱回復(fù)突變。（三）突變特點(diǎn)7個(gè)共同點(diǎn)：微生物的遺傳變異和育種第22頁(yè)（四）基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性試驗(yàn)證實(shí)

變量試驗(yàn)又稱彷徨試驗(yàn)或波動(dòng)試驗(yàn)材料：噬菌體T1——涂布在平板上作為所抗環(huán)境原因；對(duì)噬菌體T1敏感E.coli——待試驗(yàn)菌株結(jié)論：a.抗噬菌體T1突變型是自發(fā)產(chǎn)生，且產(chǎn)生越早，抗性菌落出現(xiàn)就越多。

b.噬菌體T1僅起到淘汰原始未突變菌株和甄別抗噬菌體突變型作用，并不是誘導(dǎo)因素。微生物的遺傳變異和育種第23頁(yè)變量試驗(yàn)大腸桿菌稀釋培養(yǎng)物10ml10ml(在同一個(gè)大管中作整體培養(yǎng))(培養(yǎng)前先分成50小管)3714435抗噬菌體菌落數(shù)抗噬菌體菌落數(shù)微生物的遺傳變異和育種第24頁(yè)涂布試驗(yàn)涂布敏感菌5×104個(gè)共12個(gè)平板5×104個(gè)菌落5000個(gè)細(xì)菌/菌落6個(gè)平板共353個(gè)菌落6個(gè)平板共28個(gè)菌落噴入T1保溫重新涂布后噴入T1保溫結(jié)論：該抗性突變發(fā)生在與噬菌體T1接觸之前，噬菌體加入只起到甄別該類自發(fā)突變是否發(fā)生、存在，決不是誘發(fā)該類突變?cè)?。微生物的遺傳變異和育種第25頁(yè)影印培養(yǎng)試驗(yàn)原始敏感菌種影印培養(yǎng)無(wú)藥培養(yǎng)基含藥培養(yǎng)基結(jié)論：對(duì)鏈霉素敏感E.coliK12細(xì)胞在未接觸過任何一點(diǎn)鏈霉素條件下，由1——2——4——5——6——8——9——10——12……移種可篩選出大量抗鏈霉素突變株。微生物的遺傳變異和育種第26頁(yè)(五）基因突變機(jī)制

突變機(jī)制是多樣性，能夠是自發(fā)或誘發(fā)，詳細(xì)見下列圖。微生物的遺傳變異和育種第27頁(yè)誘發(fā)突變：簡(jiǎn)稱誘變，指經(jīng)過人為方法，利用物理、化學(xué)或生物原因顯著提升基因自發(fā)突變幾率伎倆。1.誘變機(jī)制誘變劑：能夠提升突變幾率任何原因。堿基置換

移碼突變

染色體畸變微生物的遺傳變異和育種第28頁(yè)（1） 堿基置換它只包括一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換，屬于經(jīng)典點(diǎn)突變。嘌呤置換嘌呤（嘧啶置換嘧啶）——轉(zhuǎn)換嘌呤置換嘧啶或者嘧啶置換嘌呤——顛換

A..TA..TA..TG..

CA..BU酮式G..BU烯醇式置換G..

CA..BUG..

BUA..BUG..

CA..T烯醇式酮式微生物的遺傳變異和育種第29頁(yè)（2）移碼突變指誘變劑使DNA序列中一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸增加或降低，從而使該部位后面全部遺傳密碼閱讀框架改變，引發(fā)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤一類突變。移碼突變屬于DNA輕微損傷，也是一個(gè)點(diǎn)突變，由移碼突變所產(chǎn)生突變株稱為移碼突變株。移碼突變幾個(gè)情況以下列圖示

微生物的遺傳變異和育種第30頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第31頁(yè)移碼突變結(jié)果：正常鏈上增加或是缺失1、2或4、5個(gè)堿基時(shí)，均可引發(fā)移碼突變，而增加或缺失3或6個(gè)不影響讀碼，只引發(fā)較短增加或缺失。微生物的遺傳變異和育種第32頁(yè)（3）染色體畸變包含染色體結(jié)構(gòu)缺失、重復(fù)、插入、易位、倒位幾個(gè)情況，也包含染色體數(shù)目標(biāo)改變。1〉染色體內(nèi)畸變：只包括一條染色體上改變，上述幾個(gè)均可發(fā)生。倒位：斷裂下來一段染色體逆轉(zhuǎn)，然后，重新插入到原位置。易位：斷裂下來一小段染色體再順向或逆向地插入同一染色體其它部位上。2〉染色體間畸變：非同源染色體間易位。一小段DNA斷下后，可跳到另一條染色體上插入；質(zhì)粒上DNA跳到另一個(gè)質(zhì)粒上，此種情況亦屬于染色體間畸變。（原核微生物僅一條染色體，不存在“另一條”。)嚴(yán)格地說，DNA從一個(gè)細(xì)胞跳到另一個(gè)細(xì)胞易位，亦屬于染色體間畸變?？傊?，原核、真核微生物都存在染色體間畸變。微生物的遺傳變異和育種第33頁(yè)2.自發(fā)突變機(jī)制自發(fā)突變：生物體在無(wú)人工干預(yù)下自然發(fā)生低頻突變。自發(fā)突變?cè)蚱胀ㄓ校罕尘拜椛浜铜h(huán)境原因誘變比如：宇宙輻射、南北極磁場(chǎng)等。微生物本身有害代謝產(chǎn)物誘變效應(yīng)比如：過氧化氫、過氧化物等。DNA復(fù)制過程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤引發(fā)據(jù)統(tǒng)計(jì)，DNA鏈在每次復(fù)制中每個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配頻率是10-7-10-11，這么一個(gè)基因自發(fā)突變幾率約為10-6。微生物的遺傳變異和育種第34頁(yè)

紫外線對(duì)DNA損傷是引發(fā)相鄰嘧啶形成嘧啶二聚體（TT，TC，CC）。造成局部DNA分子無(wú)法配對(duì)。微生物有各種修復(fù)受損DNA作用，現(xiàn)舉兩例：光復(fù)活作用經(jīng)紫外線照射誘變微生物馬上暴露在可見光下，則微生物死亡率和突變率將顯著降低現(xiàn)象，稱光復(fù)活作用。機(jī)理：誘變形成嘧啶二聚體在暗處結(jié)合光激活酶，在有可見光情況下，此酶吸收光能，解離嘧啶二聚體。

暗修復(fù)作用又稱切除修復(fù)，經(jīng)紫外線誘變損傷DNA在不見光條件下，依靠微生物體內(nèi)四種酶來修復(fù)受損DNA。即：內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、DNA聚合酶、連接酶。過程如下列圖（六）紫外線對(duì)DNA損傷及其修復(fù)微生物的遺傳變異和育種第35頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第36頁(yè)二、突變與育種（一）自發(fā)突變與育種從生產(chǎn)中育種在利用微生物進(jìn)行大生產(chǎn)過程中，微生物會(huì)以10-6左右突變率自發(fā)突變，其中可能出現(xiàn)一定幾率正突變株。2)定向培育優(yōu)良菌株。利用自然突變，對(duì)微生物群體采取特定選擇條件選育出優(yōu)良菌株。但總來說，方法古老，自發(fā)突變目標(biāo)性不強(qiáng)，周期長(zhǎng)。微生物的遺傳變異和育種第37頁(yè)（二）誘變育種

誘變育種是指利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻而分散微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提升基礎(chǔ)上，采取簡(jiǎn)便、快速和高效篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目標(biāo)突變株，以供科學(xué)試驗(yàn)或生產(chǎn)實(shí)踐使用。（無(wú)目標(biāo)誘變，有目標(biāo)篩選）微生物的遺傳變異和育種第38頁(yè)誘變育種基本步驟出發(fā)菌株計(jì)算出誘變大多死亡少數(shù)存活存活率多數(shù)未變少數(shù)突變突變率多數(shù)負(fù)變少數(shù)正變正變率多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大高產(chǎn)率投產(chǎn)率多數(shù)不宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)微生物的遺傳變異和育種第39頁(yè)2、誘變育種應(yīng)考慮幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：

選擇簡(jiǎn)便有效誘變劑，如紫外線、激光和離子束，烷化劑、堿基類似物等。

艾姆斯試驗(yàn)(Amestest）：是一個(gè)利用細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型回復(fù)突變來檢測(cè)環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑簡(jiǎn)便有效方法.

利用微生物營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型（his—）回復(fù)突變來檢測(cè)環(huán)境或食品中化學(xué)致癌劑。（“三致”致癌，致畸，致突變）微生物的遺傳變異和育種第40頁(yè)艾姆斯試驗(yàn)(Amestest）：是一個(gè)利用細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型回復(fù)突變來檢測(cè)環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑簡(jiǎn)便有效方法.

利用微生物營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型（his—）回復(fù)突變來檢測(cè)環(huán)境或食品中化學(xué)致癌劑。（“三致”致癌，致畸，致突變）保溫可疑“三致”試樣鼠肝勻漿（含羥化酶）吸入濾紙片S.t.his陽(yáng)性陰性S.t.his回變微生物的遺傳變異和育種第41頁(yè)挑選優(yōu)良出發(fā)菌株。A.選生產(chǎn)中自發(fā)突變菌株;B.已含有優(yōu)良性狀菌株;C.對(duì)誘變劑敏感性較高菌株等。處理單細(xì)胞或單孢子懸液。目標(biāo)：使每個(gè)細(xì)胞均勻接觸誘變劑并預(yù)防長(zhǎng)出不純菌落。選取最正確誘變劑量。紫外線劑量指強(qiáng)度與作用時(shí)間之乘積;化學(xué)誘變劑劑量則以在一定外界條件下，誘變劑濃度與處理時(shí)間來表示。充分利用復(fù)合處理協(xié)同效應(yīng)。該法包含同一誘變劑重復(fù)使用，兩種或各種誘變劑先后或同時(shí)使用。微生物的遺傳變異和育種第42頁(yè)利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量之間相關(guān)指標(biāo)。如淀粉水解試驗(yàn)，就是利用淀粉酶變色圈（用碘液顯色）大小來預(yù)計(jì)突變代謝產(chǎn)物量多少。設(shè)計(jì)或創(chuàng)造高效篩選方案。如在實(shí)際中，篩選工作常分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。3、營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株篩選（重點(diǎn)）1）與篩選營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株相關(guān)三類培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基（MM，[-]）：僅能滿足某一微生物野生型菌株生長(zhǎng)所需要最低成份組合培養(yǎng)基，（該培養(yǎng)基都是人工培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型菌株不能在其上生長(zhǎng)）。微生物的遺傳變異和育種第43頁(yè)②完全培養(yǎng)基（CM，[+]）：全部營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型菌株均可在其上生長(zhǎng)培養(yǎng)基。普通地，完全培養(yǎng)基是天然或半人工合成。③補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM，[A]、[B]或[AB]）：凡只能滿足對(duì)應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株生長(zhǎng)需要組合或半組合培養(yǎng)基2）與篩選營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株相關(guān)三類遺傳型個(gè)體①野生型：從自然界分離到?jīng)]有發(fā)生過任何突變，能夠在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌株。②營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型：野生型菌株因?yàn)橥蛔?，失去了合成某種酶能力，使得該酶產(chǎn)物不能產(chǎn)生，只能在加有這種產(chǎn)物培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌株。該型不能在[-]上生長(zhǎng)，只能在[+]或?qū)?yīng)補(bǔ)充培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。該型非本身合成。微生物的遺傳變異和育種第44頁(yè)③原養(yǎng)性：營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型經(jīng)回變或其它基因改造，回復(fù)為與野生型相同形狀菌株.（與野生型從現(xiàn)象上無(wú)任何區(qū)分。）3）營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型篩選方法普通要經(jīng)過誘變、淘汰野生型、檢出和判定營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型四個(gè)步驟。①步誘變劑處理：與普通誘變處理相同②步淘汰野生型（即篩選出基因突變類型），現(xiàn)舉兩種方法。A．抗生素法（最慣用）。a．青霉素：抑制細(xì)胞壁肽聚糖合成，故可殺死生長(zhǎng)、繁殖狀態(tài)細(xì)菌，對(duì)休眠狀態(tài)無(wú)用。方法：將誘變后菌培養(yǎng)到含青霉素基本培養(yǎng)基上，即野生型被淘汰，留下為休眠狀態(tài)營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型。微生物的遺傳變異和育種第45頁(yè)

b．制霉菌素：主要與真菌細(xì)胞膜上甾醇作用，引發(fā)膜損傷。方法：將誘變后孢子培養(yǎng)到含制霉菌素基本培養(yǎng)基上，基本培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌絲者為營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型。B．菌絲過濾法：適合用于進(jìn)行絲狀生長(zhǎng)真菌和放線菌。其原理是：在基本培養(yǎng)基中，野生型菌株孢子能發(fā)芽成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型孢子則不能?？捎么罂撞羚R紙重復(fù)過濾篩選出。微生物的遺傳變異和育種第46頁(yè)A．夾層培養(yǎng)法（“三明治”狀）

③步檢出缺點(diǎn)型現(xiàn)舉出四種方法：小菌落是第二次長(zhǎng)起來（營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型）微生物的遺傳變異和育種第47頁(yè)B．限量補(bǔ)充培養(yǎng)法

在基本培養(yǎng)基上，加微量天然成份（不一樣于補(bǔ)充培養(yǎng)基），營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型形成微菌落，而野生型形成正常大小菌落。微量蛋白質(zhì)完全培養(yǎng)基上小菌落是營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株微生物的遺傳變異和育種第48頁(yè)C．逐一檢出法將誘變處理細(xì)胞涂在含有完全培養(yǎng)基平板，長(zhǎng)成菌落，再將其接種至基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)菌落（為營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型）。含誘變劑液體培養(yǎng)基菌種涂布培養(yǎng)基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)菌落完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型微生物的遺傳變異和育種第49頁(yè)D．影印平板法完全培養(yǎng)基影印接種基本培養(yǎng)基將誘變處理細(xì)胞涂不于含有完全培養(yǎng)基平板，長(zhǎng)出菌落，利用影印接種工具將該菌落轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，亦長(zhǎng)出菌落，將前后相應(yīng)菌落對(duì)比，若前者生長(zhǎng)，而后者不生長(zhǎng)菌落，為營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型（類似“平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)”）。微生物的遺傳變異和育種第50頁(yè)④步判定缺點(diǎn)型（采取生長(zhǎng)譜法）生長(zhǎng)譜法:指在混有供試菌平板表面點(diǎn)加微量營(yíng)養(yǎng)物,視某營(yíng)養(yǎng)物周圍有否長(zhǎng)菌來確定供試菌營(yíng)養(yǎng)要求一個(gè)快速、直觀方法。操作：將營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型細(xì)胞（或孢子）洗下，用無(wú)菌水離心清洗，制成菌懸液并與基本培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，用含有不一樣營(yíng)養(yǎng)物濾紙片覆蓋，如某濾紙片周圍有微生物生長(zhǎng)圈，則為該營(yíng)養(yǎng)物營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型。該法優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便，不怕污染菌，回復(fù)突變細(xì)胞不影響結(jié)果，此方法又可測(cè)定雙重或多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型。返回目錄微生物的遺傳變異和育種第51頁(yè)

第三節(jié)基因重組

基因重組定義：把兩個(gè)不一樣性狀個(gè)體遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間重新組合，形成新遺傳型個(gè)體方式，稱基因重組或遺傳重組?；蛑亟M能夠了解成遺傳物質(zhì)分子水平上雜交，即核酸水平上雜交。而傳統(tǒng)意義上雜交通常指是細(xì)胞水平雜交，如雜交動(dòng)物、雜交植物等。但全部細(xì)胞水平上雜交都是以基因重組為基礎(chǔ)。微生物基因重組分原核微生物和真核微生物兩大類進(jìn)行研究。微生物的遺傳變異和育種第52頁(yè)一、原核微生物基因重組

原核微生物基因重組包含轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合和原生質(zhì)體融合等四種形式。微生物的遺傳變異和育種第53頁(yè)（一）轉(zhuǎn)化

受體菌直接吸收來自供體菌DNA片段，經(jīng)過交換、把它整合到自己基因組中，從而使受體菌取得了供體菌部分遺傳性狀現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化結(jié)果是形成轉(zhuǎn)化子。即轉(zhuǎn)化子是經(jīng)過轉(zhuǎn)化取得供體細(xì)胞部分遺傳物質(zhì)并表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)性狀重組受體菌。而來自供體菌DNA片段稱轉(zhuǎn)化因子。轉(zhuǎn)化過程見下列圖

微生物的遺傳變異和育種第54頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第55頁(yè)（一）轉(zhuǎn)化

兩個(gè)菌株間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化與各種原因相關(guān)，如兩個(gè)菌株進(jìn)化過程中親緣關(guān)系、供體DNA形式及菌株詳細(xì)生理狀態(tài)等，其中最主要是受體菌生理狀態(tài)——感受態(tài)。供體DNA片段形式：不一樣形式供體菌DNA片段，發(fā)生轉(zhuǎn)化頻率也有區(qū)分，其中質(zhì)粒形式DNA片段發(fā)生轉(zhuǎn)化頻率最高。微生物的遺傳變異和育種第56頁(yè)（一）轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)染：將噬菌體或病毒DNA或RNA提取出來，再去感染感受態(tài)宿主細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生正常噬菌體或病毒后代現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染不一樣：轉(zhuǎn)化是受體菌接收供體菌DNA片斷、發(fā)生基因重組并產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)染過程不發(fā)生基因重組，受體菌僅接收噬菌體或病毒DNA或RNA、不產(chǎn)生雜種性質(zhì)轉(zhuǎn)化子，產(chǎn)生是大量子代噬菌體或病毒。微生物的遺傳變異和育種第57頁(yè)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)

轉(zhuǎn)導(dǎo)：經(jīng)過完全缺點(diǎn)或部分缺點(diǎn)噬菌體為媒介，將供體菌DNA片段攜帶到受體菌中，經(jīng)過交換、整合，使后者取得前者遺傳性狀現(xiàn)象，稱之為轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)子：經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)取得供體細(xì)胞部分遺傳性狀重組受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體：攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體或轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。分類：普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)局部轉(zhuǎn)導(dǎo)微生物的遺傳變異和育種第58頁(yè)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)分：轉(zhuǎn)化：受體菌直接接收供體菌DNA片段。轉(zhuǎn)導(dǎo)：受體菌經(jīng)過噬菌體接收供體菌DNA片段。微生物的遺傳變異和育種第59頁(yè)

１、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)完全缺點(diǎn)噬菌體：當(dāng)某噬菌體感染供體菌后，在供體菌內(nèi)增殖時(shí)，使供體菌DNA被切成許多片段，成熟后少數(shù)衣殼將供體菌DNA片段（要求與噬菌體核酸片段相仿）“誤包”，形成假噬菌體，即完全缺點(diǎn)噬菌體;當(dāng)供體菌被裂解此完全缺點(diǎn)噬菌體釋放后，再次感染受體菌，即可把外源（供體菌）DNA片段介導(dǎo)到受體菌中，實(shí)現(xiàn)交換和整合，這就是完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。微生物的遺傳變異和育種第60頁(yè)完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(compietetransduction)供體A-B+A+B-多數(shù)受體形成溶源菌A-B+A+B-少數(shù)受體A+B+經(jīng)重組形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子A-B+色氨酸缺點(diǎn)型A+B-組氨酸缺點(diǎn)型鼠傷寒沙門氏菌微生物的遺傳變異和育種第61頁(yè)

（2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)完全缺點(diǎn)噬菌體感染受體后，所攜帶DNA片段沒有和受體菌DNA片段交換、整合、復(fù)制，但能夠轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生對(duì)應(yīng)代謝產(chǎn)物，有對(duì)應(yīng)表型；受體菌再經(jīng)分裂、繁殖，子一代只有二分之一取得供體菌DNA片段，另二分之一僅得到部分代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出輕微供體菌特征，在繼續(xù)分裂過程中，逐步被稀釋，此現(xiàn)象稱為流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。見下列圖：微生物的遺傳變異和育種第62頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第63頁(yè)

2、局部轉(zhuǎn)導(dǎo)部分缺點(diǎn)噬菌體:溫和噬菌體感染受體菌后，使宿主溶源化。該溶源菌因誘導(dǎo)發(fā)生裂解時(shí)，其中極少數(shù)前噬菌體會(huì)發(fā)生不正常切離，將噬菌體結(jié)合位點(diǎn)兩側(cè)之一少數(shù)基因連接到噬菌體DNA上，同時(shí)噬菌體也會(huì)將對(duì)應(yīng)一段DNA留在宿主染色體組上，最終噬菌體衣殼將非正常切離噬菌體染色體進(jìn)行誤包，即形成了部分缺點(diǎn)噬菌體。

微生物的遺傳變異和育種第64頁(yè)

2、局部轉(zhuǎn)導(dǎo)定義：經(jīng)過部分缺點(diǎn)溫和噬菌體將供體少數(shù)特定基因攜帶到受體菌，并得到表示轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象，稱之為局部轉(zhuǎn)導(dǎo).局部轉(zhuǎn)導(dǎo)特點(diǎn)：（1）只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌個(gè)別特定基因（噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)基因）。（2）特定基因由部分缺點(diǎn)型噬菌體攜帶。（3）缺點(diǎn)噬菌體是因?yàn)槠湓谛纬蛇^程中產(chǎn)生低頻率“誤切”，或雙重溶原菌裂解而成。分類：局部轉(zhuǎn)導(dǎo)按其轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率高低可分為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT）兩大類。微生物的遺傳變異和育種第65頁(yè)

（1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）溫和噬菌體感染受體菌后使宿主溶源化，該溶源菌因誘導(dǎo)后發(fā)生裂解，形成10-5百分比部分缺點(diǎn)噬菌體，他們感染受體菌后發(fā)生交換、整合，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子），而不是溶源菌，不具免疫性，亦稱低頻局限轉(zhuǎn)導(dǎo)。見下列圖微生物的遺傳變異和育種第66頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第67頁(yè)

（2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT）用低頻裂解物（含10-5部分缺點(diǎn)噬菌體）來感染受體菌，即有10-5變?yōu)榈皖l局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子，再用高感染復(fù)數(shù)正常噬菌體去感染低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子，此時(shí)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子稱為雙重溶源菌，它被誘導(dǎo)后可產(chǎn)生裂解，正常噬菌體可幫助缺點(diǎn)噬菌體進(jìn)行等量復(fù)制，用這么裂解物（高頻裂解物，含50%正常噬菌體）再去感染受體菌，進(jìn)行高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，亦稱高頻局限轉(zhuǎn)導(dǎo)。微生物的遺傳變異和育種第68頁(yè)（三）溶源轉(zhuǎn)變溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時(shí)，將噬菌體基因整合到宿主核基因組形成前噬菌體，而使后者取得了除免疫性以外新性狀現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)分：1、溫和噬菌體本身不攜帶外源基因，使宿主帶有新性狀是噬菌體本身基因。2、溫和噬菌體是完整非缺點(diǎn)。3、取得新性狀是溶源化宿主細(xì)胞而不是轉(zhuǎn)導(dǎo)子。4、取得性狀可隨噬菌體消失而同時(shí)消失。微生物的遺傳變異和育種第69頁(yè)（四）接合供體菌（雄性）經(jīng)過性菌毛與受體菌接觸，前者將不一樣長(zhǎng)度單鏈DNA片段傳遞給后者并在后者細(xì)胞中雙鏈化，深入與核染色體交換、整合，使受體菌取得供體菌部分遺傳性狀現(xiàn)象，稱為接合。經(jīng)過接合而取得供體菌性狀受體細(xì)胞，稱為接合子。微生物的遺傳變異和育種第70頁(yè)經(jīng)過細(xì)胞間直接接觸能進(jìn)行大段ＤＮＡ轉(zhuǎn)移過程，叫接合接合及其發(fā)現(xiàn)+A+B+C-D-

A-B-C+D+

A+B+C+D+微生物的遺傳變異和育種第71頁(yè)（四）接合以E.coli為例，按細(xì)胞內(nèi)有沒有F因子及其存在方式不一樣可分為四種：1、F+（雄性）菌株有游離F因子1—4個(gè)，體外有對(duì)應(yīng)數(shù)量性菌毛，當(dāng)其與F-菌株接合時(shí)，經(jīng)過性菌毛可將F因子傳遞給后者，使之轉(zhuǎn)變?yōu)镕+菌株。2、F-(雌性)菌株體內(nèi)無(wú)F因子，體外亦無(wú)性菌毛，它可經(jīng)過與F+菌株、F′菌株或Hfr菌株接合而接收F因子或F′因子，使自己變成“雄性”菌株，也可接收來至Hfr菌株一部分或全部遺傳信息。微生物的遺傳變異和育種第72頁(yè)

3、Hfr（高頻重組）菌株因其與F-菌株結(jié)合后，發(fā)生重組頻率比F+要高數(shù)百倍，故得名。在這么菌體內(nèi)，F(xiàn)因子呈整合狀態(tài)，整合位點(diǎn)固定；當(dāng)它與F-結(jié)合時(shí)，Hfr菌株染色體在F因子處斷裂，由環(huán)狀變?yōu)榫€狀，F(xiàn)因子位于線性DNA末端。然后整條線性染色體以等速轉(zhuǎn)移至F-菌株內(nèi)，因轉(zhuǎn)移所需時(shí)間較長(zhǎng)，且輕易發(fā)生中止，造成Hfr與F-結(jié)合結(jié)果其重組頻率最高，但轉(zhuǎn)性頻率最低。微生物的遺傳變異和育種第73頁(yè)

4、F′菌株當(dāng)Hfr菌株內(nèi)F因子因不正常切離而脫離染色體時(shí)，形成帶了一小段Hfr染色體基因特殊F因子，即F′因子。此時(shí)性狀界于Hfr與F+菌株之間，稱初生F′菌株；F′菌株與F-菌株結(jié)合，后者也變成F′菌株。它既取得了F因子，又取得了來自初生F′菌株若干新性狀，成為次生F′菌株。次生F′細(xì)胞是一部分雙倍體。以這種結(jié)合來傳遞供體基因方式，稱為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)、性導(dǎo)、F質(zhì)粒媒介轉(zhuǎn)導(dǎo)。微生物的遺傳變異和育種第74頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第75頁(yè)(五)原生質(zhì)體融合

經(jīng)過人為方法，使遺傳性狀不一樣兩細(xì)胞原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進(jìn)而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時(shí)帶有雙親性狀、穩(wěn)定融合子過程。

微生物的遺傳變異和育種第76頁(yè)微生物的遺傳變異和育種第77頁(yè)原生質(zhì)體融合主要步驟：①親本選擇選擇兩個(gè)有特殊價(jià)值，并帶有選擇性遺傳標(biāo)識(shí)細(xì)胞作為親本；②原生質(zhì)體制備在高滲溶液中，利用脫壁酶（溶菌酶）進(jìn)行親本脫壁，形成原生質(zhì)體；③原生質(zhì)體融合加入促融合劑（如PEG）或電脈沖等促進(jìn)融合；④融合子判定先在能使細(xì)胞壁再生培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布培養(yǎng)，待形成菌落后，再影印接種到選擇性培養(yǎng)基上，判定其是否為融合子；⑤生物學(xué)性狀及生長(zhǎng)性能測(cè)定。微生物的遺傳變異和育種第78頁(yè)原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)微生物的遺傳變異和育種第79頁(yè)二、真核微生物基因重組（一）有性雜交：凡能產(chǎn)生有性孢子酵母菌或霉菌，標(biāo)準(zhǔn)上都能夠經(jīng)過性細(xì)胞接合而發(fā)生