試驗(yàn)四人毛囊的快速提取及檢測(cè)性別

試驗(yàn)四人毛囊的快速提取及檢測(cè)性別第1頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰褼NA的快速提取方法及其原理掌握DNA的電泳檢測(cè)技術(shù)學(xué)習(xí)PCR擴(kuò)增DNA的原理，掌握PCR操作步驟掌握利用PCR技術(shù)擴(kuò)增SRY基因判斷性別的原理第2頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月試驗(yàn)內(nèi)容一毛囊DNA的快速提取與檢測(cè)二PCR擴(kuò)增進(jìn)行性別鑒定第3頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月前期準(zhǔn)備前期處理：挑出毛發(fā)10根，盡量剪短至只剩下毛囊，去除毛根，放入干凈的EP管中。加入PH8.0的滅菌水清洗1-2次，離心后吸出水第4頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR擴(kuò)增進(jìn)行性別鑒定PCR試驗(yàn)原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是當(dāng)今現(xiàn)代分子生物學(xué)的三大主流技術(shù)之一。第5頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)用濃度為1-2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物（DNA）進(jìn)行電泳分離。瓊脂糖凝膠中有很多小孔隙，起一個(gè)分子篩的作用，DNA在電場(chǎng)的作用下由負(fù)極往正極移動(dòng)穿過這些孔隙，DNA遷移速率與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與DNA分子量大小成反比。從而將大小不同的DNA片段分離開來。SRYPCR產(chǎn)物大?。?01bpGAPDHPCR產(chǎn)物大小：565bp第8頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR擴(kuò)增體系10ul總體系：H2O7×10=70Buffer1.010Primer-F0.33Primer-R0.33dNTP0.33Taq0.11Template(毛囊DNA)1.0ul

第10頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR擴(kuò)增程序95℃,4min;94℃,30s;60℃,30s;72℃,30s;Goto230循環(huán)72℃,5min;4℃,5min.第11頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月方法一酚仿抽提法試劑：10%SDS、蛋白酶K(20mg/ml)、苯酚、氯仿、異戊醇、乙醇TE10mmol/LTris-Hcl,PH=8.0;1mmol/LEDTA,PH=8.0步驟第12頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月酚仿抽提法優(yōu)缺點(diǎn)：該方法提取的DNA濃度不是很高，中間步驟過多會(huì)損失大量的DNA，所以如果是很細(xì)小的毛，并且量不多，不建議使用此方法。但是此方法提取的DNA質(zhì)量較好，擴(kuò)增效果好。

第14頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月酚仿抽提法圖1.酚仿抽提法檢測(cè)結(jié)果第15頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月方法二、堿裂解法于裝有毛囊的EP管中加入0.2mol/L的NaOH溶液50μL，煮沸15min后，瞬時(shí)離心，吸取上清液至另外一只干凈的離心管中加入PH=6左右的Tris–HCl50μL，13000r離心2min將上清液轉(zhuǎn)移到另外一只EP管中即可。第16頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月方法二、堿裂解法優(yōu)缺點(diǎn)：該方法提取步驟較簡(jiǎn)單，提取周期短，并且DNA損失量較少，提取效率高。但PH值不容易調(diào)節(jié)以至于會(huì)影響到后續(xù)PCR擴(kuò)增。因此如果PCR擴(kuò)增效率不高的引物，不建議用該方法提取。第17頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月方法三、PCR擴(kuò)增法

試劑：10×PCR緩沖液、Mg2+、蛋白酶K(20mg/ml)實(shí)驗(yàn)步驟：按以下體系配制毛囊裂解液：10×PCR緩沖液100μLMg2+80μL蛋白酶K(20mg/ml)1μLddH2O819μL第18頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月方法三、PCR擴(kuò)增法加入上述裂解液15μL于放有毛囊的EP管中在PCR儀上設(shè)置一個(gè)單循環(huán)程序:

65℃30min,95℃15min,4℃10min。將上一步驟中的PCR試管放入預(yù)熱好的PCR儀中,運(yùn)行該程序；吸取上清液于干凈的EP管中即可；

第19頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月方法三、PCR擴(kuò)增法優(yōu)缺點(diǎn)：該方法提取DNA的效率較高，可獲得較多的DNA，并且需要的毛囊量較少。較細(xì)且少量的毛囊建議用此方法提取DNA。但是該方法抽提的DNA質(zhì)量不是很好，擴(kuò)增的時(shí)候需加大DNA加入量，并且擴(kuò)增的結(jié)果中可能會(huì)有大量雜帶。第20頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月圖2：PCR法抽提檢測(cè)結(jié)果

第21頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳檢測(cè)制備1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)DNA具有結(jié)合EB分子的能力，在紫外燈下產(chǎn)生熒光的信號(hào)第22頁，課件共26頁，創(chuàng)作于2023年2月二PCR擴(kuò)增進(jìn)行性別鑒定性別鑒定原理人類男性的性染色體組成是XY，女性的性染色體組成是XX，因而通過對(duì)一些在Y染色體上所特有的基因（如SRY基因）進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，即可對(duì)性別進(jìn)行鑒定。本試驗(yàn)通過對(duì)毛囊DNA中的SRY基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析進(jìn)行性別鑒定，擴(kuò)增呈陽性的為男性，擴(kuò)增呈陰性的為女性。同時(shí)以常染色體上的GAPDH基因?yàn)殛栃?/p>