急性和慢性帕金森病大鼠血腦屏障通透性變化的研究

急性和慢性帕金森病大鼠血腦屏障通透性變化的研究【摘要】目的通過(guò)觀察帕金森病大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中伊文斯藍(lán)(EB)含量變化來(lái)探討急性和慢性PD大鼠血腦屏障通透性的變化。方法腦立體定向?qū)?羥基多巴胺注入大鼠右側(cè)紋狀體建立PD模型。將大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和模型組，后者又分為6h，12h，24h，4周組，最后一組為慢性PD組。按BELAYEV法使用EB測(cè)定BBB通透性。結(jié)果急性PD大鼠BBB通透性在6h達(dá)到高峰，12h逐漸下降，持續(xù)至24h，慢性PD大鼠與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。結(jié)論急性PD時(shí)伴有BBB的通透性增加，而慢性PD時(shí)BBB的通透性未見(jiàn)改變。

【關(guān)鍵詞】帕金森病；血腦屏障；伊文斯藍(lán)

Abstract：ObjectiveTostudythealterationofblood-brainbarrier(BBB)withparkinsondiseasemeasuredbyEBcontentinthebraintissueofratswithacuteandchronicparkinsonparkinsondiseasemodelwasestablishedbydirectinjectionof6-OHDAintotherightstriatumratswererandomlydividedintocontrolgroupandmodelratsinmodelgroupwerekilledathour6,hour12,hour24andweeklastgroupwaschronicparkinsonDiseaseratBBBpermeabilitywasassessedbyBelyaev‘sBBBpermeabilityreachedthepeakathour6after6-OHDAacutelesion,thendecreasedathour12,lasteduntil24h.TheBBBpermeabilityofchronicparkinsondiseaseratshadnosignificantdifferenceascomparedwithcontrolgroup.ConclusionThepermeabilityofBBBwillincreaseinacuteparkinsondiseaseratsbuthasnochangeinchronicityparkinsondiseaserats.

Keywords：ParkinsonDisease;Blood-brainbarrier;EvensBlue

帕金森病是一種常見(jiàn)的中老年性疾病，主要病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)部位多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性死亡［1］，引起紋狀體內(nèi)DA遞質(zhì)含量顯著降低。6羥基多巴胺作為DA神經(jīng)元的化學(xué)切斷劑，注入腦內(nèi)可引起DA神經(jīng)細(xì)胞急性損傷致DA含量下降。短期應(yīng)用可致急性PD模型，長(zhǎng)期應(yīng)用可制作慢性PD模型。我們將6OHDA注入鼠腦右側(cè)紋狀體分別建立急性和慢性PD模型，通過(guò)測(cè)量傷側(cè)腦組織伊文斯藍(lán)(EvensBlue，EB)含量來(lái)觀察血腦屏障通透性的改變，以探討B(tài)BB的改變?cè)诩毙院吐訮D發(fā)生中的作用。

1儀器與材料1儀器和試劑腦立體定位儀，牙科鉆，VarioskanFlash型酶標(biāo)儀，HM202型十萬(wàn)分之一天平，HHS精密電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)，高速冷凍離心機(jī)；6OHDA(sigma公司)，阿樸嗎啡(sigma公司)，甲酰胺，伊文斯藍(lán)(上海新中化學(xué)廠生產(chǎn))，Millipore超純水系統(tǒng)。2動(dòng)物分組健康雄性Wistar大鼠，體重220～250g室溫20～25℃,濕度50%～70%飼養(yǎng)，白天-黑夜分別12h睡眠和活動(dòng)，自由進(jìn)食、飲水。隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，后者按損傷后不同觀察時(shí)相點(diǎn)又分為6h，12h，24h，4周組。每組6只。

2方法

動(dòng)物模型制作實(shí)驗(yàn)鼠用%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上，齒桿較耳桿低約mm。頭皮正中切口約6cm，剝離骨膜，暴露前囟。定位方法依據(jù)Paxinos＆Watson所著《TheRatBraininStereotaxicCoordinates》找到前囟。在右側(cè)紋狀體鉆一直徑為1mm的小孔，用固定于立體定位儀上的微量注射器延針孔垂直進(jìn)針。模型組：用10μl微量注射器抽取6μl6OHDA注入右側(cè)紋狀體內(nèi)，注射速度μl/min，進(jìn)藥后留針15min，退針5min?？p合頭皮，腹腔注射慶大霉素以預(yù)防感染。對(duì)照組：接受同樣位點(diǎn)的注射，注射生理鹽水6μl，其他過(guò)程同模型組。術(shù)后放回籠中，單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飼料，自由進(jìn)食、飲水。

行為學(xué)檢測(cè)篩選慢性PD模型第4組實(shí)驗(yàn)鼠術(shù)后第2周開(kāi)始經(jīng)皮下注射新鮮配制的阿樸嗎啡，檢測(cè)大鼠旋轉(zhuǎn)行為。每周1次，直至術(shù)后4周。手動(dòng)記數(shù)每分鐘旋轉(zhuǎn)次數(shù)及30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)總次數(shù)。恒定向損傷對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)超過(guò)7r/min的大鼠視為陽(yáng)性，連續(xù)4周陽(yáng)性者為合格的慢性PD動(dòng)物模型。

伊文斯藍(lán)測(cè)定實(shí)驗(yàn)鼠在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)麻醉后，經(jīng)股靜脈注入2%EB生理鹽水溶液,幾秒鐘后大鼠眼球、結(jié)膜、四肢等均顯示藍(lán)色，表明注入成功。2h后快速開(kāi)胸暴露心臟，迅速穿刺左心室后剪右心耳一小孔，用37℃生理鹽水灌注致右心耳流出無(wú)色清亮液體，以清除血液中的染料，斷頭取腦，取損傷側(cè)半球。用甲酰胺消化法測(cè)腦組織中EB含量：取損傷側(cè)腦半球組織標(biāo)本，稱濕重后置于盛有3ml的甲酰胺試管中，60℃恒溫水浴箱中孵育48h，使腦組織中的EB充分溶解在甲酰胺溶液中。將溶有EB的甲酰胺溶液3000r/min離心15min,取上清液，用酶標(biāo)儀在EB最大吸收光譜630nm處測(cè)其光密度值。BBB通透性用每克組織中含有EB的含量表示相關(guān)系數(shù)r=5,其相關(guān)和回歸效果均非常顯著，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用±s表示。采用軟件，組間比較用t檢驗(yàn)，多組比較用方差分析。α=為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

3結(jié)果

行為學(xué)觀察第4組實(shí)驗(yàn)鼠在術(shù)后第2周開(kāi)始，皮下注射阿樸嗎啡后2min左右，大鼠即開(kāi)始向損傷對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)且速度7r/min，身體向左屈成環(huán)狀，頭尾銜接，以右側(cè)后肢為支點(diǎn)，伴覓食樣動(dòng)作。并且出現(xiàn)尾僵直、豎毛，頭、身體向左側(cè)偏斜。

EB定量檢測(cè)結(jié)果如表1顯示，與對(duì)照組相比，急性PD大鼠損側(cè)半球的EB含量在6h顯著增加并且達(dá)到高峰()，之后逐漸降低，持續(xù)至24h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組。而4周后即慢性PD大鼠損側(cè)半球的EB含量未見(jiàn)增加，與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。

表1損傷側(cè)腦組織EB含量的變化

與對(duì)照組比較，*P＜，**P＜；n=7

4討論

PD大鼠模型分為急性損傷模型和慢性損傷模型［2］。急性損傷模型常用的方法是將6OHDA注射至黑質(zhì)、紋狀體或者內(nèi)側(cè)前腦束,使DA能神經(jīng)元在數(shù)小時(shí)內(nèi)快速的死亡。這種急性損傷模型一般都是伴隨慢性損傷模型制作過(guò)程中出現(xiàn),多應(yīng)用于神經(jīng)組織移植和基因治療研究中［3］。慢性損傷模型制作方法與前者相同，DA能神經(jīng)元的快速損傷后持續(xù)至數(shù)周并且伴有行為學(xué)的變化,被用來(lái)模擬PD的慢性病程［4］。

BBB是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接、基膜以及毛細(xì)血管周?chē)哪z質(zhì)細(xì)胞足突構(gòu)成［5］，其中內(nèi)皮細(xì)胞及緊密連接是BBB的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。BBB的特殊的結(jié)構(gòu)使得98%的小分子化合物和幾乎全部的大分子都不能透過(guò)大腦［6］，從而保持穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。目前腦或CNS疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的一種疾病，PD病因不明、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近幾年的研究表明，加速老化、線粒體能量代謝障礙［7］、自由基的形成［8］、炎性介質(zhì)和NO的釋放在PD發(fā)病中起著重要作用，而諸如自由基、一些炎性介質(zhì)和NO等血管活性物質(zhì)的釋放可能增加了BBB的通透性，打破了穩(wěn)定的腦內(nèi)環(huán)境。

本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計(jì)法檢測(cè)滲入腦組織中EB含量，定量評(píng)價(jià)了急性和慢性PD時(shí)血腦屏障的損害程度。研究表明，6OHDA所致急性PD大鼠BBB的通透性在6h增加并達(dá)到高峰，之后呈下降趨勢(shì)，持續(xù)至24h仍有明顯的增加。而經(jīng)過(guò)行為學(xué)篩選的慢性PD大鼠BBB的通透性未發(fā)生改變。結(jié)合以往研究分析，初步認(rèn)為6-OHDA急性損傷時(shí)釋放了一些致炎物質(zhì)，由于致炎細(xì)胞因子的上調(diào)，促使中性粒細(xì)胞粘附到血管壁，導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜損害，使BBB的通透性增加。其次過(guò)量自由基的釋放可導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸過(guò)氧化，過(guò)氧化物損害了腦血管壁，破壞了BBB完整性。而慢性PD模型歷時(shí)較長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)4周的時(shí)間曾經(jīng)打開(kāi)過(guò)的BBB又關(guān)閉，因此只能檢測(cè)到極少量EB的滲入，但與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，BBB損傷受多因素、多環(huán)節(jié)之間的相互作用，互為因果，形成惡性循環(huán)。因此保護(hù)BBB的完整性可能是減輕6-OHDA急性損傷的重要措施。深入研究在急性PD時(shí)造成BBB損傷的各種機(jī)理，從不同的環(huán)節(jié)干預(yù)該病的病理過(guò)程，期望找到新的靶點(diǎn)并研發(fā)出有效的治療藥物，為PD的治療開(kāi)拓新的應(yīng)用前景。

【參考文獻(xiàn)】

［1］KimJ，InoueK，IshiiJ，eta1．AMicroRNAfeedbackcircuitinmidbraindopamineneu-rons［J］.Science，2007，317(5842)：1220.

［2］牛朝詩(shī)，李健.立體定向技術(shù)注射6-OHDA至內(nèi)側(cè)前腦束建立帕金森病大鼠模型［J］.立體定向和功能性神經(jīng)外科雜志，2007，20：19.

［3］CarmanLS,GageFH,Shultslesionofthesubstantianigra:relationbetweenextentoflesionandrotationalbehavior［J］.BrainRes,1991,553(2):275.

［4］師長(zhǎng)宏，周少波.帕金森病和L-DOPA誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)障礙動(dòng)物模型［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，2002，12：254.

［5］李金輝，萬(wàn)海同.腦缺血血腦屏障損傷分子機(jī)制及中醫(yī)藥防治研究近況［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32：127.

［6］