生物分離工程細(xì)胞分離與破碎

總體學(xué)習(xí)目的和要求

通過本章學(xué)習(xí)，要求掌握解細(xì)胞分離和目標(biāo)產(chǎn)物的釋放的原理和方法，熟知各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍。

當(dāng)前第1頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)目錄重力沉降離心沉降細(xì)胞破碎與胞內(nèi)物釋放當(dāng)前第2頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－學(xué)習(xí)要點(diǎn)識記：重力沉降、離心沉降和過濾的概念。理解：重力沉降、離心分離與過濾原理、理論；掌握Stokes沉降公式

。應(yīng)用：常用離心方法及優(yōu)缺點(diǎn)；利用掌握的提高分離效率的方法分析決實(shí)際問題

當(dāng)前第3頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－重力沉降定義

重力沉降是傳統(tǒng)化工過程中常用的從含有固體顆粒的流體中將顆粒分離出來的操作。

重力沉降是利用流體與顆粒間的密度差，在重力的作用下使顆粒與流體之間產(chǎn)生相對運(yùn)動，從而實(shí)現(xiàn)兩者的分離。

在生物分離過程中，定義中顆粒為細(xì)胞、細(xì)胞碎片等有形物當(dāng)前第4頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)千姿百態(tài)的微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture當(dāng)前第5頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－重力沉降理論理論假設(shè)細(xì)胞或細(xì)胞碎片按照球形顆粒處理；顆粒在無限稀釋的溶液中進(jìn)行沉降，顆粒之間無相互干擾

受力分析

球形顆粒重力fg液體的浮力fb顆粒運(yùn)動方向相反的阻力

fs當(dāng)前第6頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－重力沉降理論重力：浮力：阻力：當(dāng)前第7頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－重力沉降理論當(dāng)球形顆粒自身的重力與其所受到浮力和阻力達(dá)到平衡時，

則當(dāng)前第8頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－重力沉降理論當(dāng)球形顆粒處于滯流區(qū)（）時

Stokes公式當(dāng)球形顆粒處于過渡區(qū)（）時

Allen公式當(dāng)球形顆粒處于湍流區(qū)（）時Newton公式當(dāng)前第9頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)千姿百態(tài)的微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture球形顆粒？無限稀釋溶液？當(dāng)前第10頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－重力沉降理論模型校正形態(tài)校正：顆粒的形狀系數(shù)速度校正：空隙率函數(shù)

提高重力沉降的途徑加入中性鹽：雙電層排斥電位降低加入高分子絮凝劑：架橋作用形成大絮凝圖引入外力當(dāng)前第11頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－重力沉降理論模型校正

形態(tài)校正速度校正提高重力沉降的途徑

加入中性鹽；加入高分子絮凝劑

引入外力當(dāng)前第12頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－離心沉降定義離心沉降是利用沉降設(shè)備使流體和顆粒旋轉(zhuǎn)，在離心力的作用下，由于顆粒和流體間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產(chǎn)生相對運(yùn)動，從而使顆粒和流體分離。當(dāng)前第13頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－離心沉降理論離心沉降速度

令：當(dāng)前第14頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－離心分離方法差速離心分級區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心當(dāng)前第15頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)差速離心分離差速離心是以菌體細(xì)胞的收集或除去為目的的固液離心分離方法，應(yīng)用某一特定顆粒沉淀的離心力在預(yù)定的離心時間內(nèi)得到一部分顆粒沉淀及包含未沉淀顆粒的上清液。當(dāng)前第16頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)差速離心分離應(yīng)用實(shí)例600g10min15000g10min100000g60min300000g120minnucleiMitochondrialysosomesPlasmamembraneRiosomalsubunitshomogenateFilteredhomogenateSolublepartofcytoplasmSedimentation當(dāng)前第17頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)區(qū)帶離心分離－前提

在離心管內(nèi)的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同濃度（密度）的梯度介質(zhì)（蔗糖等），按照濃度從大到小的原則，依次層層加入。加入離心管中的梯度介質(zhì)經(jīng)高速離心或靜置后可形成連續(xù)的密度梯度。當(dāng)前第18頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)操作過程當(dāng)前第19頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)區(qū)帶離心種類差速區(qū)帶離心(速度區(qū)帶離心）平衡區(qū)帶離心（等密度離心）當(dāng)前第20頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)差

速

區(qū)

帶

離

心當(dāng)前第21頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)差速區(qū)帶離心基于顆粒的大小、形狀的分離梯度液的最大密度不能超過所分離顆粒的最大密度離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等動態(tài)離心分離方法當(dāng)前第22頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)平衡區(qū)帶離心當(dāng)前第23頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)平衡區(qū)帶離心梯度液密度范圍含蓋全部待分離顆粒密度離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等平衡離心分離方法當(dāng)前第24頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)梯度液的種類和應(yīng)用當(dāng)前第25頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－區(qū)帶離心異同區(qū)帶離心種類差速區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心共同點(diǎn)事先在離心管內(nèi)用低分子量溶質(zhì)調(diào)配好密度梯度梯度介質(zhì)常用蔗糖常用氯化銫密度梯度最大的密度梯度低于最大密度的沉降樣品最大的密度梯度大于最大密度的沉降樣品區(qū)帶形成條件根據(jù)各個組分沉降系數(shù)的差別，形成各自的區(qū)帶根據(jù)各組分密度差形成區(qū)帶離心條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時間，低速度使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高速度

當(dāng)前第26頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－離心設(shè)備分類分類方法名稱處理量實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)，工業(yè)用離心機(jī)溫度常溫離心機(jī)、冷凍離心機(jī)轉(zhuǎn)速低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)管式、碟式當(dāng)前第27頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－常用離心設(shè)備Solids-ejectingdiskbowlcentrifugeofpilotsizeforsterilizablecontainedinstallation

Nozzlemachinewithpressurizedsolidsdischargeforyeastandbacteriaseparation

當(dāng)前第28頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－常用離心設(shè)備Decantercentrifuge

Multichamberbowl,verticalcut

當(dāng)前第29頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－管式離心設(shè)備AdisposablecellseparationinsertPowerfugeTMone-chamberwithscraper當(dāng)前第30頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－碟片離心設(shè)備(a)Solids-retainingdiskbowl,(b)Radialsolids-ejectingdiskbowl,topfeed.(c)Radialsolids-ejectingdiskbowl,hermeticfeed.(d)Axialsolids-ejectingdiskbowl.(e)Nozzlebowlwithpressurizedsolidsdischarge.(f)Nozzlebowlwithperipheraldischargenozzles.當(dāng)前第31頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－離心設(shè)備比較管式離心機(jī)優(yōu)點(diǎn)結(jié)構(gòu)簡單，轉(zhuǎn)速和離心力較大缺點(diǎn)沉降面積小、處理能力低；碟式離心機(jī)優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)子中存在隔板以增大沉降面積，處理能力大缺點(diǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、轉(zhuǎn)速較低；當(dāng)前第32頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－離心機(jī)處理能力粒子在徑向上的沉降速度

軸向移動速度

完全沉降的邊界條件

當(dāng)前第33頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－離心機(jī)處理能力影響因素

處理樣品的特性，如密度、粒徑等溶液的特性，如密度、粘度等離心機(jī)機(jī)械結(jié)構(gòu)，如r1和r2操作條件，ω

當(dāng)前第34頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－過濾定義過濾是利用多孔性介質(zhì)（如濾布）截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分離的方法。過濾本身是一種膜分離技術(shù)。在分離細(xì)胞、菌體或它們的碎片過程中除了沉降分離方法外，過濾技術(shù)也是一種常備的分離方法。當(dāng)前第35頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－過濾過程受力分析推動力：過濾操作以壓力差為主要推動力；

阻力：過濾過程的阻力來自多孔性過濾介質(zhì)和介質(zhì)表面不斷堆積形成的濾餅

當(dāng)前第36頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－過濾速率Rm表示介質(zhì)的阻力；Rc表示濾餅的阻力；μL為濾液的粘度當(dāng)前第37頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－恒壓過濾方程Ruth恒壓過濾方程其中，K為Ruth恒壓過濾系數(shù)，表示為當(dāng)前第38頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞分離－提高過濾速度的途徑采用絮凝或凝聚的方法預(yù)處理改變料液的性質(zhì)，降低濾餅阻力加入助濾劑以改變?yōu)V餅的壓縮性指數(shù)，提高過濾速度當(dāng)前第39頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放

－學(xué)習(xí)要點(diǎn)理解：各種細(xì)胞破碎方法原理、優(yōu)缺點(diǎn)及其適用范圍。應(yīng)用：采用不同的細(xì)胞破碎方法對不同細(xì)胞進(jìn)行不同程度的破碎。當(dāng)前第40頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放

－細(xì)胞結(jié)構(gòu)（真核細(xì)胞與原核細(xì)胞）動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，只有由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞膜植物細(xì)胞細(xì)胞膜外有一層堅固的細(xì)胞壁酵母細(xì)胞細(xì)胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，更加難以破碎真核細(xì)胞原核細(xì)胞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁由肽聚糖層組成，壁厚約15～50nm，肽聚糖含量為40~90%，細(xì)胞壁較革蘭氏陰性菌堅固。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁在肽聚糖的外側(cè)還有分別由（1）脂蛋白和（2）磷脂和脂多糖構(gòu)成的兩層外壁層，外壁層厚度越8～10nm。當(dāng)前第41頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放

－細(xì)胞膜組成（A）（B）當(dāng)前第42頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放

－影響產(chǎn)物釋放的環(huán)境因素在復(fù)雜培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細(xì)胞其破碎較單一培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細(xì)胞更難；對數(shù)生長期的細(xì)胞會表現(xiàn)得更加脆弱。從連續(xù)培養(yǎng)過程中獲得的、具有較高比生長速率的念珠菌的細(xì)胞壁更加脆弱，而搖瓶培養(yǎng)的念珠菌體則有更加充裕的機(jī)會構(gòu)建更加堅固的細(xì)胞壁。酵母細(xì)胞壁的厚度和破碎阻力隨年齡增長而增加經(jīng)常在幼酵母細(xì)胞中出現(xiàn)的芽痕（Budscars）可引起酵母細(xì)胞局部細(xì)胞壁強(qiáng)度的降低當(dāng)前第43頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放

－細(xì)胞破碎原理細(xì)胞破碎機(jī)械破碎高壓均漿法，珠磨法、撞擊破碎、超聲波破碎非機(jī)械破碎物理法滲透壓沖擊、凍結(jié)-融化、（超聲波）化學(xué)法酸堿處理、化學(xué)試劑處理生物法酶溶、自溶、噬菌體當(dāng)前第44頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放

－機(jī)械破碎之高壓勻漿細(xì)胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速（可達(dá)到450m/s）噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。

當(dāng)前第45頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放

－機(jī)械破碎之珠磨珠磨機(jī)的破碎室內(nèi)填充有80～85％（v/v）的玻璃（密度為2.5g/ml）或氧化鋯（密度為6.0g/ml）的微球（粒徑約0.1~1.0mm）。在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動，微球與微球之間以及微球和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。當(dāng)前第46頁\共有48頁\編于星期四\19點(diǎn)