實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡的使用演示文稿

實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡的使用演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)熒光顯微鏡的使用實(shí)驗(yàn)二目前二頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理及其使用方法。目前三頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)實(shí)驗(yàn)用品

熒光顯微鏡及熒光裝置附件。人口腔上皮細(xì)胞裝片，植物莖部組織裝片。目前四頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理

熒光顯微鏡是一種較為常用的光學(xué)顯微鏡。它是由光源、濾色鏡系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。 其基本原理是利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，從而用于對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。

目前五頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)透射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡暗場(chǎng)聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈箱目前六頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)透射熒光顯微鏡原理

目鏡吸收濾色鏡物鏡暗場(chǎng)聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈透射熒光顯微鏡原理目前七頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)反射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡

標(biāo)本目前八頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理

某些物質(zhì)經(jīng)波長(zhǎng)較短的光照射后，分子被激活,吸收能量后呈激發(fā)態(tài)。 其能量部分轉(zhuǎn)化為熱能或用于光化學(xué)反應(yīng)外，相當(dāng)一部分則以波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光能形式輻射出來(lái)，這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見光稱為熒光。 熒光顯微鏡是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。

目前九頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)什么是熒光?

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。目前十頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)保持固有的熒光特性熒光波長(zhǎng)＞激發(fā)波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒光的性質(zhì)目前十一頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高對(duì)細(xì)胞的刺激小能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察熒光的有無(wú)、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途目前十二頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)熒光光源的作用 熒光光源不是作為照明的，而是作為熒光色素產(chǎn)生熒光的激發(fā)光。目前十三頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理

熒光有兩種類型，一種是標(biāo)本自身的原有熒光（自發(fā)熒光），另一種是利用熒光色素和細(xì)胞的特定部分反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光（次生熒光）。 自發(fā)熒光：在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線照射后能直接發(fā)射出熒光的稱為自發(fā)熒光（或直接熒光）。如植物組織中的葉綠素，經(jīng)紫外線照射后，即可發(fā)出紅色熒光。 次生熒光：有些生物組織經(jīng)紫外線照射后，并不能發(fā)出熒光，但是當(dāng)它吸收熒光染料后也可以產(chǎn)生熒光，稱為次生熒光（或間接熒光）。如吖啶橙，DAPI均可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的核酸。目前十四頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)組成

一、光源

由于標(biāo)本發(fā)出的熒光和激發(fā)光相比，是非常微弱的，因此熒光顯微鏡的光源強(qiáng)度必須很高，所以對(duì)于熒光顯微鏡的光源我們通常采用高壓汞燈。 汞燈能以最小的表面發(fā)出最大數(shù)量的紫外光和藍(lán)光，且光亮度大，光度穩(wěn)定。它是用石英玻璃制作，中間呈球形，有兩個(gè)鎢電極，內(nèi)充一定數(shù)量的汞和少量氬氖混合氣體。目前十五頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)一、光源

工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過(guò)程一般約需5～15min。 超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)。

超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。

目前十六頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)

200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動(dòng)一次工作時(shí)間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。 因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)。燈泡在使用過(guò)程中其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)。 點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。

一、光源目前十七頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)

超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。 在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。 由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強(qiáng)烈，因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作。

一、光源目前十八頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn) 濾色鏡按用途或功能，主要分為兩類：1、激發(fā)濾色鏡（exciterfilter）

對(duì)于光源發(fā)出的混合光，選擇透過(guò)能使標(biāo)本產(chǎn)生熒光的特定波長(zhǎng)的光，同時(shí)阻擋對(duì)激發(fā)熒光無(wú)關(guān)的光。 熒光染料均有一定的吸收光譜（激發(fā)峰值），利用濾色鏡對(duì)光線選擇吸收的能力，選用其透射光譜，恰為熒光染料的最大吸收光譜（激發(fā)峰值）的激發(fā)濾色鏡，以便從汞燈發(fā)出的廣譜光波中，選擇透過(guò)最宜波段的光線供用。二、濾色鏡系統(tǒng)目前十九頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)

2、阻擋濾色鏡（barrierfilter）

阻擋濾色鏡是用來(lái)阻擋掉沒有被標(biāo)本吸收的激發(fā)光和某些波長(zhǎng)較短的光線以及沒有被選擇透過(guò)的熒光，以防傷害眼睛。

阻擋濾色鏡的選用，應(yīng)視熒光染料的熒光光譜而定，要能夠最大限度的透過(guò)所需熒光并阻斷短波光以及不需要波長(zhǎng)的熒光。二、濾色鏡系統(tǒng)目前二十頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)

濾鏡一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn)。 如德國(guó)產(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的第一個(gè)字母，G是玻璃的第一個(gè)字母； 我國(guó)產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾鏡名為QB24，Q是青色（藍(lán)色）拼音的第一個(gè)字母，B是玻璃拼音的第一個(gè)字母。 不過(guò)有的濾鏡也可以透光分界波長(zhǎng)命名，如K530，就是表示阻擋波長(zhǎng)530nm以下的光而透過(guò)530nm以上的光。還有的廠家的濾鏡完全以數(shù)字命名，如美國(guó)Corning廠的NO.5-58，即相當(dāng)于BG12。二、濾色鏡系統(tǒng)目前二十一頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)

3、二向色鏡（DM）

二向色鏡位于汞燈激發(fā)濾色鏡構(gòu)成的平行光軸與目鏡和物鏡構(gòu)成的豎直光軸的兩軸垂直相交處,斜向安裝于光路之中。與照明光路成45°角，承擔(dān)色光的分流作用。 二向色鏡對(duì)激發(fā)光波長(zhǎng)的光（即透過(guò)激發(fā)濾光片的光），有很高的反射率。 而對(duì)由標(biāo)本發(fā)出的熒光波長(zhǎng)區(qū)的光，則有很高的透射率，即二色向鏡起著反射激發(fā)光和透過(guò)熒光的重要作用。

二、濾色鏡系統(tǒng)目前二十二頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)

一個(gè)濾光鏡系統(tǒng)（即一個(gè)濾光塊）由激發(fā)濾色鏡、二向色鏡、阻擋濾色鏡（三部分組成。

通過(guò)以上激發(fā)濾光片、二向色鏡、阻擋濾光片的相應(yīng)組合，可以形成多種不同的激發(fā)方法，如紫外（UV）、紫（V）、蘭（B）和綠（G）等（這些名稱是以激發(fā)光主波長(zhǎng)的顏色而定的）。

尼康所提供的濾光塊種類很多，按客戶要求選擇配套。二、濾色鏡系統(tǒng)目前二十三頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn) 熒光顯微鏡按激發(fā)光對(duì)樣品的激發(fā)方向或方式，分有兩種：

1．透射式熒光顯微鏡

2．反射式（落射式）熒光顯微鏡三、熒光顯微鏡的光路目前二十四頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn) 激發(fā)光束通過(guò)聚光器穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光的，誘發(fā)的熒光從物鏡前方進(jìn)入物鏡。這是比較舊式的熒光顯微鏡。 其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱，所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好。1．透射式熒光顯微鏡目前二十五頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)透射熒光顯微鏡原理

目鏡吸收濾色鏡物鏡暗場(chǎng)聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈透射熒光顯微鏡原理目前二十六頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)透射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡暗場(chǎng)聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈箱目前二十七頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn) 這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，是激發(fā)光從物鏡后部進(jìn)入物鏡，向下落射樣品，激發(fā)出熒光，熒光反射向上再進(jìn)入物鏡。

2．反射式熒光顯微鏡目前二十八頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)目前二十九頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)反射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡

標(biāo)本目前三十頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)反射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈紫外線保護(hù)罩孔徑光欄（FS）視場(chǎng)光欄（AS）目前三十一頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)反射式熒光顯微鏡原理 落射光激發(fā)的熒光法是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來(lái)的一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。 它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。

目前三十二頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn) 如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。 此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻,成像清晰,放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。2．反射式熒光顯微鏡目前三十三頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)透射式落射式目前三十四頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)四、熒光顯微鏡使用方法1．打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。 落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／二向色鏡／阻斷濾片的插塊。目前三十五頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)3.用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心,使其位于整個(gè)照明光斑中央。4.放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意： 未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼損傷； 用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無(wú)熒光的特殊油鏡； 高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。四、熒光顯微鏡使用方法目前三十六頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)熒光觀察的基本調(diào)整步驟

調(diào)整汞燈象，讓其聚焦對(duì)中心。調(diào)整步驟：

（1）將調(diào)心工具旋在空出的物鏡轉(zhuǎn)換器孔上，并讓其進(jìn)入光路。

（2）打開前光閘，讓落射光進(jìn)入光路。（注：調(diào)汞燈象中心時(shí)，一般采用B波段的濾光塊）

（3）通過(guò)調(diào)心工具的觀察窗口，將汞燈象聚焦對(duì)中心

a.當(dāng)泵燈象在投影平面的外部時(shí)，旋動(dòng)位于燈室外部的橫向和縱向的調(diào)中心旋鈕將汞燈象（尚未聚焦）接近投影平面中心。

b.再旋動(dòng)位于燈室外部的聚焦旋鈕，使汞燈象聚焦在投影平面上。

c.再次旋動(dòng)橫向和縱向調(diào)中心旋鈕，將汞燈象最終清晰地固定在中心。

（4）旋下調(diào)心工具，重新旋上物鏡。

讓標(biāo)本進(jìn)入光路，選擇適當(dāng)波段濾光塊進(jìn)入光路，并用10X物鏡聚焦。

對(duì)目鏡進(jìn)行適度和瞳距調(diào)節(jié)。

視場(chǎng)光闌對(duì)中心。

轉(zhuǎn)換所需倍率的物鏡觀察標(biāo)本。目前三十七頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：

1.

照明方式通常為落射式，即光源通過(guò)物鏡投射于樣品上；

2.

光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；

3.

有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人眼。目前三十八頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)熒光素的特性目前三十九頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)口腔上皮細(xì)胞目前四十頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)口腔上皮細(xì)胞熒光目前四十一頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)松樹莖部橫切面目前四十二頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)松樹莖部橫切面熒光目前四十三頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)松樹莖部橫切面目前四十四頁(yè)\總數(shù)五十一頁(yè)\編于十點(diǎn)松樹莖部橫切面熒光目