生物統(tǒng)計(jì)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)NNNSNP檢測技術(shù)

內(nèi)容簡介1

SNP概念2

SNP特點(diǎn)3

SNP檢測技術(shù)4

實(shí)驗(yàn)?zāi)壳耙豁揬總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)等位基因和基因型位于一對同源染色體的同一位置（基因型）上、控制相對性狀的兩個(gè)不同形式的基因叫等位基因。

一個(gè)基因由于突變（包括中性突變）可形成2個(gè)以上的等位基因，不同的等位基因可產(chǎn)生不同的遺傳特征的變化，同時(shí)控制相對性狀的顯、隱性關(guān)系和遺傳效應(yīng)。如由突變形成的多種等位基因可產(chǎn)生多種異常表型。目前二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)正常基因稱為野生型基因：具有野生型基因的細(xì)胞或個(gè)體稱為野生型（wildtype）。

基因突變（genemutation）：攜帶突變基因的各種類型的細(xì)胞或個(gè)體稱為突變體或突變型（mutant）。目前三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)一、SNP的概念單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)，指由于單個(gè)核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個(gè)體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象，即SNP。一般而言，SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。它包括單堿基的轉(zhuǎn)換,顛換、插入及缺失等形式A/G、A/T、A/C、C/G、C/T和G/T轉(zhuǎn)換的發(fā)生頻率占多數(shù)目前四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)二、SNP在基因組內(nèi)的形式:一是遍布于基因組的大量單堿基變異;二是分布在基因編碼區(qū)(codingregion),稱其為cSNP，屬功能性突變。

SNP在單個(gè)基因或整個(gè)基因組的分布是不均勻的：（1）非轉(zhuǎn)錄序列要多于轉(zhuǎn)錄序列（2）在轉(zhuǎn)錄區(qū)非同義突變的頻率,比其他方式突變的頻率低得多。目前五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)三、SNP的特點(diǎn)在遺傳學(xué)分析中,SNP作為一類遺傳標(biāo)記得以廣泛應(yīng)用,主要源于這幾個(gè)特點(diǎn):（1）密度高

SNP在人類基因組的平均密度估計(jì)為1\1000bp,在整個(gè)基因組的分布達(dá)3×106個(gè),遺傳距離為2～3cM,密度比微衛(wèi)星標(biāo)記更高,可以在任何一個(gè)待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo)記。（2）富有代表性某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平,因此,它們可能代表疾病遺傳機(jī)理中的某些作用因素。目前六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)（3）遺傳穩(wěn)定性

與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比,SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性。（4）易實(shí)現(xiàn)分析的自動化

SNP標(biāo)記在人群中只有兩種等位型(allele)。這樣在檢測時(shí)只需一個(gè)“+\-”或“全\無”的方式，而無須象檢測限制性片段長度多態(tài)性，微衛(wèi)星那樣對片段的長度作出測量，這使得基于SNP的檢測分析方法易實(shí)現(xiàn)自動化。目前七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)四、多態(tài)性與突變的區(qū)別1、多態(tài)性是一個(gè)群體概念，多態(tài)性指這個(gè)差異占群體的1%以上。否則就叫突變（小于1%）2、SNP是多態(tài)性中的一種，只是進(jìn)一步限定了差異只是單堿基。3、SNP一般來說，是全部體細(xì)胞一樣的基因型（除開嵌合體）。4、突變一般不是一個(gè)個(gè)體全部細(xì)胞的變化。5、如果突變發(fā)生在生殖細(xì)胞，則可以遺傳，但是只要這個(gè)突變?nèi)簺]有達(dá)到總?cè)后w的1%，它就只是一個(gè)突變株/系。達(dá)到了1%就是多態(tài)性了。目前八頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)五、SNPs經(jīng)典檢測方法一大類是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法,如:1.限制性片段長度多態(tài)性法PCR-RFLP;2.單鏈構(gòu)象多態(tài)性法PCR-SSCP;3.變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE);4.等位基因特異性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等另一類，基因芯片、二代測序技術(shù)目前九頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)（一）PCR-RFLP方法

原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點(diǎn)，酶切片斷的長度和數(shù)量則會出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點(diǎn)。特點(diǎn)：該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP的位點(diǎn)必須含有該限制內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，它是SNP篩查中最經(jīng)典的方法之一.目前十頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)PCR-RFLP原理圖目前十一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)（二）單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)

原理：單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)，不同的二級結(jié)構(gòu)在電泳中會出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級結(jié)構(gòu)依賴于堿基的組成，單個(gè)堿基的改變也會影響其構(gòu)象，最終會導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變。在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現(xiàn)不同的條帶，檢測SNP。特點(diǎn)：由于該方法簡單快速，因而被廣泛運(yùn)用于未知基因突變的檢測。這種方法的弊端在于不能確定突變類型和具體位置。目前十二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)目前十三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)（三）變性梯度凝膠電泳（DGGE）原理：是利用長度相同的雙鏈DNA片段解鏈溫度不同的原理,通過梯度變性膠將DNA片段分開的電泳技術(shù)。電泳開始時(shí),DNA在膠中的遷移速率僅與分子大小有關(guān),而一旦DNA泳動到某一點(diǎn)時(shí),即到達(dá)該DNA變性濃度位置時(shí),使得DNA雙鏈開始分開,從而大大降低了遷移速率。當(dāng)遷移阻力與電場力平衡時(shí),DNA片段在凝膠中基本停止遷移。由于不同的DNA片段的堿基組成有差異,使得其變性條件產(chǎn)生差異,從而在凝膠上形成不同的條帶。目前十四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)目前十五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)（四）等位基因特異PCR(AS-PCR)原理：根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物,其中一條鏈(特異鏈)的3′末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同),另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì),因此,AS-PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記。因?yàn)樘禺愐镌谝环N基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物,在另一種基因型中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無,從而確定基因型的SNP。目前十六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)目前十七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)PCR條件優(yōu)化TaqDNA聚合酶：1-5U/100ul,濃度過高-非特異擴(kuò)增，過低-產(chǎn)量不足。dNTP:20-200μmol/L,四種濃度要相等，任何一種不等都會發(fā)生錯(cuò)配。Mg++濃度：0.5-2.5mmol/L,一般反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200μmol/L時(shí)，Mg2+濃度為為宜，過高-非特異性，過低-酶活性降低。引物濃度：μmol/L,過高—錯(cuò)配、特異擴(kuò)增，二聚體目前十八頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)模版濃度、質(zhì)量100-200ng/100ul偏向性擴(kuò)增的解決所謂偏向性擴(kuò)增是因?yàn)镾NP位點(diǎn)上會往往存在嘌吟和嘧啶的替換，在PCR過程中，聚合反應(yīng)對嘧啶(C或T)比較敏感，使得嘌吟(A或T)的擴(kuò)增非常少，而出現(xiàn)偏向性擴(kuò)增，這在SNP位點(diǎn)附近嘌吟含量較高時(shí)特別明顯。解決方案：（1）PCR擴(kuò)增循環(huán)保持一個(gè)絕對低的水平；（2）在樣本中加入0.1NNaOH使DNA變性為單鏈，經(jīng)中和后加入全基因組擴(kuò)增試劑。（3）巢式PCR-RFLP”基因分型技術(shù)目前十九頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)AAAAGGAAGATCCCAATTTTCCTTCTAGGGTTAAAAGTAAGATCCCAATTTTCATTCTAGGGTT目前二十頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)QIAGENREPLI-g試劑盒目前二十一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)PCR反應(yīng)出現(xiàn)的問題與對策1、假陽性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。二是空氣中的小片段核酸污染目前二十二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)解決方法：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。目前二十三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)2、出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。

原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。目前二十四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)對策：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。目前二十五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)3、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。目前二十六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：這個(gè)方法是最便宜的，不需要酶切，一次PCR就可以得到GENOTYPING的信息。缺點(diǎn)：PCR對于3'端的特異性在不同退火溫度時(shí)有出入，所以退火溫度的摸索很關(guān)鍵，否則假陽性擴(kuò)增是很容易的。另外，內(nèi)參照的設(shè)置也很重要，這個(gè)東西還是很有意思的。而且，所使用的引物位置無法人為調(diào)整，只能放在SNP的5'段。目前二十七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)其基本原理是利用PCR引物的3’端，對SNP位點(diǎn)附近的堿基進(jìn)行人為改造，產(chǎn)生一個(gè)常規(guī)的限制性內(nèi)切酶識別序列，如SNPrs1321425（rs1321425－來自NCBI的refSNP數(shù)據(jù)庫）的C/G，其任何一個(gè)堿基和上下游堿基無法形成一個(gè)可直接被限制性內(nèi)切酶識別的序列，于是對SNP位點(diǎn)前的上游堿基進(jìn)行改造，（五）巢式PCR-RFLP技術(shù)目前二十八頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)NestedPCR原理示意圖FirstPCRSecondPCR目前二十九頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)通過對序列的分析和PCR效果的計(jì)算，將原本四個(gè)堿基AGAT改成CTGC，結(jié)合后一個(gè)堿基A以及SNP位點(diǎn)G，形成CTGCAG（PstI）酶切識別位點(diǎn)，經(jīng)測序和序列對比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的將2個(gè)堿基，3個(gè)堿基進(jìn)行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATAC/GACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCACTTCTGTAAACTACATGCACTAAT目前三十頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)（六）雜交+熒光共振分子信標(biāo)（雙分子間雜交）蝎狀探針（分子內(nèi)雜交）31目前三十一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)1、分子信標(biāo)（Molecularbeacons）分子信標(biāo)是一種新型的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針,是在樣品PCR過程中因和樣品DNA雜交后而使自身熒光構(gòu)象改變從而實(shí)現(xiàn)對SNP的檢測(原理見圖1)。分子信標(biāo)由稱為“莖”(stem)和“環(huán)”(loop)的兩部分構(gòu)成,莖部分是由寡核苷酸探針兩端互補(bǔ)的序列形成的,又可稱之為手臂,環(huán)則是探針的中間部分,其序列和待擴(kuò)增的目的片段互補(bǔ)并含有要檢測的SNP

位點(diǎn)。在手臂的兩個(gè)末端分別通過共價(jià)的方式結(jié)合上一個(gè)熒光分子和一個(gè)熒光猝滅基團(tuán),這樣當(dāng)分子信標(biāo)游離在溶液時(shí),它目前三十二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)以發(fā)卡結(jié)構(gòu)存在,熒光分子與猝滅基團(tuán)在空間距離上挨在一起,十分接近,熒光分子被猝滅,此時(shí)溶液無熒光信號。相反當(dāng)分子信標(biāo)和其完全互補(bǔ)的目的片段雜交時(shí),其發(fā)卡結(jié)構(gòu)被拉開而使熒光分子和熒光猝滅基團(tuán)在空間上分開從而發(fā)射出熒光,其信號可提高900倍。特異性很高,相差一個(gè)堿基的目的片段都能夠區(qū)分,因此用于SNP位點(diǎn)的檢測,同時(shí)我們可以對分子信標(biāo)標(biāo)記以不同的熒光信號,從而能夠?qū)Χ鄠€(gè)樣品的同時(shí)檢測。由于分子信標(biāo)是在樣品PCR過程中的退火時(shí)期和目的片段特異性雜交,釋放熒光,某一循環(huán)或循環(huán)后的熒光量取決于那時(shí)形成的特異的PCR產(chǎn)物,因此也用于PCR產(chǎn)物產(chǎn)量的實(shí)時(shí)檢測。目前三十三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)目前三十四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)2、蝎狀探針（Scorpionprimer）35目前三十五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)Scorpionprimer是由發(fā)卡結(jié)構(gòu)(hairpinloop)的探針部分，通過一段稱為PCRstopper(orPCRblocker)的寡核苷酸和PCR引物的5′端相連構(gòu)成。探針部分的結(jié)構(gòu)和Molecularbeacons類似,由互補(bǔ)序列構(gòu)成的“莖”和包含SNP位點(diǎn)且和待檢測目的片段。目前三十六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)而PCRstopper的作用是在PCR過程中阻止對探針部分的擴(kuò)增,避免發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)在無待檢測片段時(shí)通過擴(kuò)增被打開而產(chǎn)生錯(cuò)誤的熒光信號。在對樣品進(jìn)行檢測時(shí)以Scorpionprimer作為PCR擴(kuò)增的引物,當(dāng)其以樣品DNA作為模板延伸后,Scorpionprimer中的探針部分就可以和同一條DNA鏈上的互補(bǔ)部分雜交,而導(dǎo)致自身構(gòu)象的改變釋放出熒光信號互補(bǔ)的“環(huán)”構(gòu)成,熒光分子和猝滅基團(tuán)分結(jié)合在莖的末端,目前三十七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)目前三十八頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)

（七）SNPs高通量的檢測方法

另一大類檢測方法是近些年來發(fā)展起來的,高通量、自動化程度較高的檢測SNPs的方法,較為常用的有:1.DNA測序法;2.DNA芯片檢測;3.飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測;4.變性高效液相色譜(DHPLC)法等等目前三十九頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)1、DNA測序法直接測序是最容易實(shí)施的SNP檢測方法。原理:

通過對不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行測序和序列比較,以確定所研究的堿基是否變異,其檢出率可達(dá)100%。特點(diǎn)：可以得到SNP的類型及其準(zhǔn)確位置等SNP分型所需要的重要參數(shù)。目前四十頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)2、基因芯片技術(shù)(Genechips)

原理:是將具有特定堿基序列的探針固定在特殊的載體上，待測基因經(jīng)提取、熒光標(biāo)記后，與固定好的探針進(jìn)行雜交，最后根據(jù)熒光的強(qiáng)度和種類測出待測序列的堿基類別。

特點(diǎn)：基因芯片具有信息量大和自動化程度高的突出優(yōu)點(diǎn)。但它也存在若干問題:芯片造價(jià)高昂,所需設(shè)備貴重,不利于普及應(yīng)用。目前四十一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)3、飛行質(zhì)譜儀MALDI-TOF

原理：是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過與硅芯片上的化合物共價(jià)結(jié)合后,在硅芯片上進(jìn)行引物的退火,延伸反應(yīng),突變部位配對的堿基與正常配對的堿基不相同。根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測SNP。目前四十二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)4、變性高效液相色譜(DHPLC)原理：目標(biāo)核酸片段PCR擴(kuò)增，部分加熱變性后，含有突變堿基的DNA序列由于錯(cuò)配堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈。因包含錯(cuò)配堿基的雜合異源雙鏈區(qū)比完全配對的同源配對區(qū)和固定相的親和力弱，更易被從分離柱上洗脫下來,從而達(dá)到分離的目的。SNPs的有無最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形或數(shù)目差異,依據(jù)此現(xiàn)象可很容易從色譜圖中判斷出突變的堿基。特點(diǎn)：使用高效液相色譜檢測SNPs具有檢測效率高，便于自動化的優(yōu)點(diǎn)，對未知SNPs的準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。但DHPLC檢測對所用試劑和環(huán)境要求較高,容易產(chǎn)生誤差,不能檢測出純合突變。目前四十三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)5、MassARRAYSNP分型的方法多種多樣，MassARRAY分子量陣列技術(shù)是Sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析工具，通過引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏、可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因分型檢測?；贛assARRAY?

分子量陣列平臺的iPLEXGOLD技術(shù)可以設(shè)計(jì)最高多達(dá)40重PCR反應(yīng)和基因型檢測，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)非常靈活，分型結(jié)果準(zhǔn)確性高。特別適合于對全基因組研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，或者是有限數(shù)量的研究位點(diǎn)已經(jīng)確定的情況。目前四十四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)目前四十五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)目前四十六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)目前四十七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十點(diǎn)MassARRAY技術(shù)原理:先通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加