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文檔簡介

乙型病毒性肝炎試驗室檢驗匯報人:付紅偉天津醫(yī)大總醫(yī)院檢驗中心.1.21乙型病毒性肝炎的實驗室檢查1/37我國HBV感染概況普通人群HBsAg攜帶率高達(dá)7.18%;現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬人,占全世界1/4;其中慢性乙型病毒性肝炎患者超出

2000萬例,占全世界慢性乙肝患者1/3;15歲以下兒童HBsAg攜帶率下降顯著,1-4歲組僅為0.96%;1~4歲組HBsAb陽性率由1992年15.75%升至72.25%;抗HBcAb陽性率由1992年30.08%降至3.76%;2乙型病毒性肝炎的實驗室檢查2/37HBV基因組HBVDNA是由長鏈L(負(fù)鏈)

和短鏈S(正鏈)

組成不完全雙鏈環(huán)狀DNA,短鏈長度相當(dāng)于長鏈50%~85%。HBVDNA長鏈載有病毒蛋白質(zhì)全部密碼,有4個開放讀碼框架(ORF),分別稱為S、C、P和X區(qū)。編碼7個蛋白質(zhì)。HBVDNA易發(fā)生變異,尤其是前S或S區(qū)基因較易突變。嗜肝DNA病毒共同特點:內(nèi)含3~3.3kb渙散環(huán)狀、部分雙鏈DNA基因組及DNA聚合酶;病毒復(fù)制需逆轉(zhuǎn)錄過程。3乙型病毒性肝炎的實驗室檢查3/37HBV抗原和抗體系統(tǒng)表面抗原(HBsAg):HBV外膜糖蛋白=S+L+M蛋白

S蛋白:狹義HBsAg指S蛋白。HBsAg陽性說明機(jī)體有HBV感染。中分子蛋白:preS2+S

大分子蛋白:preS1+preS2+SS蛋白中分子蛋白大分子蛋白PreS1PreS2S1.HBsAg和抗-HBs乙型病毒性肝炎的實驗室檢查4/37e抗原(HBeAg):是可溶性蛋白質(zhì)只存在于血液中是病毒復(fù)制和傳染性標(biāo)志e抗體(抗-HBe):對HBV感染有一定保護(hù)作用其出現(xiàn)標(biāo)志著病毒復(fù)制降低、傳染性降低前C區(qū)C區(qū)前C/C蛋白HBeAgHBcAg表示切割、加工HBeAg只存在于血清中HBVC基因分泌到細(xì)胞外2.HBeAg和抗-HBe5乙型病毒性肝炎的實驗室檢查5/37HBV三種形態(tài)1,HepatitisBvirion(Daneparticle)2,secretedfilament3,secretedsphere6乙型病毒性肝炎的實驗室檢查6/377HBV自然復(fù)制周期乙型病毒性肝炎的實驗室檢查7/378生物化學(xué)檢測1HBV血清標(biāo)志物檢測2HBV分子生物學(xué)診療3HBV臨床藥品療效檢測4HBV感染試驗室檢驗乙型病毒性肝炎的實驗室檢查8/371.乙型肝炎生物化學(xué)檢測主要指標(biāo):ALT,AST,ASTm,血清白蛋白,血清膽紅素,膽堿酯酶,甲胎蛋白,凝血酶原時間(PT)及部分凝血因子;9乙型病毒性肝炎的實驗室檢查9/37方法學(xué)發(fā)展ELISA:靈敏性高,成本低,適合用于普通病人篩查;膠體金免疫層析法(金標(biāo)法):簡便易行,可用于急診病人快速檢測;化學(xué)發(fā)光法定量檢測:價格昂貴,可用于HBVMs為臨界值病人確實證;可間接反應(yīng)宿主HBV復(fù)制水平,在評價抗病毒治療病毒學(xué)應(yīng)答、療效和判斷預(yù)后方面有主要意義。新增檢測指標(biāo)Pre–S1、Pre–S2及其對應(yīng)抗體對乙肝兩對半新認(rèn)識102.HBV血清標(biāo)志物檢測乙型病毒性肝炎的實驗室檢查10/3711HBV血清標(biāo)志物檢測方法成本效果分析(1)乙型病毒性肝炎的實驗室檢查11/3712HBV血清標(biāo)志物檢測方法成本效果分析(2)Back乙型病毒性肝炎的實驗室檢查12/3713Terminal

proteinSpacerReverse

Transcriptase

(RT)RNaseHrt1rt344preS1preS2Ss1s266HBsAg乙型病毒性肝炎的實驗室檢查13/37XMutationofS&Pre-SS基因“a”決定簇

G145R

變異,與抗-HBs親和力降低S基因變異可造成隱匿性HBV感染(occultHBVinfection),表現(xiàn)為血清HBsAg陰性,但仍可有HBV低水平復(fù)制(血清HBVDNA常<104拷貝/ml)獻(xiàn)血員人群,隱匿性HBV感染檢出率可達(dá)0.19%14乙型病毒性肝炎的實驗室檢查14/3715乙型病毒性肝炎的實驗室檢查15/3716Pre–S1檢測臨床價值前S1蛋白主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上,在HBV感染宿主細(xì)胞過程及在病毒復(fù)制和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)中起主要作用;前S1抗原與HBeAg之間有高度相關(guān)性,并可區(qū)分因變異種及其它原因造成乙肝病毒e抗原(HBeAg)假陰性,可作為HBeAg假陰性補(bǔ)充,從而準(zhǔn)確反應(yīng)患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況;可作為HBV感染及復(fù)制標(biāo)注,與其它血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測,相互補(bǔ)充。Back乙型病毒性肝炎的實驗室檢查16/3717HBeAg陰性的慢乙肝患者,肝硬化年發(fā)生率8%-10%;HBeAg陽性的慢乙肝患者,肝硬化年發(fā)生率2%-5%對HBeAg陰性患者應(yīng)該開展更積極的治療大三陽小三陽vs乙型病毒性肝炎的實驗室檢查17/37HBV血清學(xué)標(biāo)志檢測結(jié)果分析16乙型病毒性肝炎的實驗室檢查18/3719類型HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb樣本數(shù)(n)組成比(%)1+---+40.212+-+-+231.203+--++985.114----+462.405---++683.556-+-++1849.607-+--+633.298-+---47024.539-----96050.10累計1257172335048619161001916例HBV血清標(biāo)志物陽性類型分布模式乙型病毒性肝炎的實驗室檢查19/3720乙型病毒性肝炎的實驗室檢查20/3721乙型病毒性肝炎的實驗室檢查21/3722HBVDNA定量檢測病毒復(fù)制水平最可靠,最直接證據(jù),與傳染性和疾病進(jìn)展親密相關(guān);主要用于HBV感染判斷,治療適應(yīng)癥選擇及抗病毒療效判斷。HBV基因分型基因分型必要性;基因分型主要方法;HBV耐藥突變檢測3.HBV分子生物學(xué)診療乙型病毒性肝炎的實驗室檢查22/37慢性HBV感染治療適應(yīng)癥選擇HBeAg陽性,HBVDNA載量>105copies/ml,ALT>2×ULN;HBeAg陰性,HBVDNA載量>104copies/ml,ALT>2×ULN;HBVDNA連續(xù)陽性,年紀(jì)>40歲,ALT大于正常上限,也可給予抗病毒治療;HBVDNA連續(xù)陽性,年紀(jì)>40歲,ALT連續(xù)正常,應(yīng)親密隨訪,動態(tài)觀察疾病進(jìn)展,必要時行肝組織檢測,有病變證據(jù)時,能夠給予抗病毒治療;23乙型病毒性肝炎的實驗室檢查23/37HBV感染抗病毒治療療效評定治療終點:HBVDNA顯著下降或低于檢測下限,并伴有ALT正常;HBVDNA水平治療開始后3個月內(nèi)連續(xù)下降1log以上才說明治療有效;每日0.5mg恩替卡韋治療1年時,HBeAg陽性和陰性慢性乙型肝炎患者HBVDNA檢測不到率分別為67%和90%,恩替卡韋HBeAg轉(zhuǎn)換率為21%,與其它口服抗病毒藥相同。并不以HBeAg轉(zhuǎn)陰或HBsAg轉(zhuǎn)陰為治療終點或目標(biāo)。24乙型病毒性肝炎的實驗室檢查24/37HBVDNA定量檢測試劑盒性能對比25乙型病毒性肝炎的實驗室檢查25/3726同時能夠?qū)崿F(xiàn)對HCV,HIV-1,衣原體,及淋病一體化檢測Back乙型病毒性肝炎的實驗室檢查26/37病毒基因突變疾病進(jìn)展臨床表現(xiàn)對干擾素應(yīng)答耐藥變異生化學(xué)改進(jìn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換HBVDNA去除急性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化(LC)肝細(xì)胞癌(HCC)27HBV基因型/基因亞型乙型病毒性肝炎的實驗室檢查27/37分型方法優(yōu)缺點序列測定法最直接,最可信,是HBV基因分型金標(biāo)準(zhǔn),但繁瑣費時而且價格昂貴,混合型檢測能力差,不適于大樣本檢測。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)較測序法簡便,適于大樣本檢測,但因為需要進(jìn)行酶切,所以操作仍較為繁瑣,成本較高,并存在酶切不徹底等問題。pre-S2單克隆抗體酶聯(lián)免疫測定(mAbsEIA法)簡單、快速,已商品化,適于大樣本檢測,但檢測費用較高并不能有效判別有些混合型感染和HBsAg低表示及一些表位表示不充分標(biāo)本。分子探針雜交法簡單、快速,對混合型檢測非常敏感,已商品化,適于大樣本檢測,但檢測費用較高而且靈敏度和特異度還有待提升。型特異性引物PCR法簡單、快速,成本低,含有較高靈敏度,適于流行病學(xué)研究和臨床大樣本檢測。但特異度還有待提升。慣用HBV基因分型方法比較28乙型病毒性肝炎的實驗室檢查28/37B型特異性“引物對”特異度分析B型特異性引物HB(正義鏈):5’-ACCGTGAACGCCCACMGGAA-3’29Back乙型病毒性肝炎的實驗室檢查29/374.HBV臨床藥品治療監(jiān)測乙肝病毒耐藥性檢測,是精準(zhǔn)治療乙肝關(guān)鍵?。‘?dāng)前因為治療不夠規(guī)范,造成我國當(dāng)前超出95%乙肝患者發(fā)生耐藥、病毒變異、病毒耐藥,變異檢測勢在必行!拉米夫定是第一個被同意治療慢性乙型肝炎口服抗病毒藥,已在全世界廣泛應(yīng)用。但其耐藥發(fā)生率高,治療1年時耐藥發(fā)生率為23%,2年為46%,3年為55%,4和5年分別為65%和71%。30乙型病毒性肝炎的實驗室檢查30/37耐藥---核苷(酸)類似物(NA)治療失敗最主要原因31拉米夫定LMV阿德福韋酯ADV替比夫定LdT恩替卡韋ETVHBV替諾福韋TDVNAs:抑制病毒復(fù)制長久使用耐藥變異乙型病毒性肝炎的實驗室檢查31/37臨床耐藥表型耐藥基因耐藥耐藥研究32乙型病毒性肝炎的實驗室檢查32/3733乙型病毒性肝炎的實驗室檢查33/3734PolymeraseTerminal

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Transcriptase

(RT)RNaseHrt1rt344逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)一些位點變異與耐藥相關(guān)preS1preS2HBsAgs1s266可同時分析:耐藥變異,HBsAg變異,基因型,血清型乙型病毒性肝炎的實驗室檢查34/37全長RT區(qū)分析技術(shù)路線HBVDNA提取snPCR擴(kuò)增RT區(qū)PCR產(chǎn)物直接測序生物信息學(xué)分析與數(shù)據(jù)

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