生物工程下游技術(shù)液相色譜用填充材

生物工程下游技術(shù)液相色譜用填充材第1頁/共34頁羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)-----一種膠體磷酸鈣，廣泛存在于人體和牛乳中，人體內(nèi)主要分布于骨骼和牙齒中，牛乳內(nèi)主要分布于酪蛋白膠粒和乳清中。實(shí)質(zhì)上是一種高度交錯(cuò)聚合的高分子磷酸鈣聚合物，其分子式為Ca10(PO4)6(OH)2，其中鈣磷元素摩爾比值為1.67。在骨骼和牙齒中，鈣和磷又主要以膠體磷酸鈣結(jié)晶形態(tài)存在，并和膠原蛋白質(zhì)共同構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。第2頁/共34頁其材料本是骨骼和牙齒等生物硬組織的主要無機(jī)成分,與生物組織有特異性的親和力和相容性。實(shí)驗(yàn)研究表明，HAP納米粒子對(duì)肝癌、胃癌、骨肉瘤等多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用。1000元/公斤第3頁/共34頁膠體磷酸鈣應(yīng)用范圍較廣，涵蓋乳品、飲料、糖果、烘焙食品及鈣片等各種需要進(jìn)行鈣強(qiáng)化的食品。在天然食品中，以鮮奶等乳制品的含鈣量最高，如果完全從這些食品中獲取鈣質(zhì)，最大的問題就是必須攝入大量食物才能得到所需的鈣質(zhì)，同時(shí)會(huì)攝入大量的熱量和脂肪，因此，攝取高鈣食品是補(bǔ)充鈣質(zhì)的最好方式。膠體磷酸鈣的鈣含量為24%，鮮奶一般的鈣含量為100mg/100ml，再額外添加0.1g/100ml的膠體磷酸鈣，奶制品的成品鈣含量即可達(dá)到120mg/100ml，達(dá)到高鈣牛奶的要求。第4頁/共34頁一、基本概念羥基磷灰石是一種弱陽離子或弱陰離子交換層析材料。優(yōu)點(diǎn):能精確地分離、純化結(jié)構(gòu)上只有微小差別的生物大分子。第5頁/共34頁二、HAP的性能高機(jī)械強(qiáng)度:可以耐受15MPa以上壓力,陶瓷HAP可以耐受幾十MPa的壓力。高柱效:球形HAP顆粒大小、形狀及孔隙大小均適合HPLC的要求，其顆粒及孔徑小，有比較高的柱效?；瘜W(xué)和熱穩(wěn)定性:是磷酸鈣鹽中最穩(wěn)定的,在中性和堿性水相中非常穩(wěn)定,溶解度很低,熱穩(wěn)定性很高,可采用高溫制備方法生產(chǎn)。低的非可逆性吸附:HAP有非常低的非可逆性吸附。表面修飾性:HAP表面比較容易進(jìn)行各種化學(xué)修飾。第6頁/共34頁三、HAP制備方法（一）通常有干法、水熱法和濕法。在正常條件下，填料粒度＞20μm時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20μm時(shí)，濕法填充較為理想。

用于色譜的HAP制備以濕法為主。第7頁/共34頁片狀Tiselius型HAP的制備:因人而得名，即以鈣鹽或氫氧化鈣與堿金屬磷酸鹽,磷酸銨或磷酸在水溶液中控制反應(yīng)條件結(jié)晶而成不規(guī)則的片狀晶體。Ca化合物P化合物轉(zhuǎn)型反應(yīng)羥基磷灰石第8頁/共34頁問題：晶體不規(guī)則—→易碎—→顆粒大小波動(dòng)—→色譜柱的填充狀態(tài)改變—→柱效降低—→重復(fù)性變差。如何解決？第9頁/共34頁日本人的專利---制造均勻HAP顆粒以CaHPO4.2H2O晶體顆粒為先導(dǎo)物質(zhì)，在高于其脫水溫度和相變溫度，而不致于發(fā)生分解的條件下加熱，首先脫水相變?yōu)镃aHPO4，然后用堿處理再轉(zhuǎn)變成晶體HAP，它大小較均勻，約1-3um厚，數(shù)微米大小。第10頁/共34頁2.粒狀HAP的制備:二次造粒:首先制備HAP微晶（微小針棒狀）,然后采用噴霧法進(jìn)行造粒(在適當(dāng)黏結(jié)劑存在下,噴霧干燥HAP微粒懸浮物成為球粒)?？朔姿?---微晶聚集成球形顆粒Ca化合物P化合物造粒二次粒子：1~100um；孔徑：80~90nm反應(yīng)一次粒子0~1um羥基磷灰石第11頁/共34頁噴霧熱解技術(shù):硝酸鈣和磷酸的甲醇溶液在800～1400oC之內(nèi)高溫噴霧熱解制備球形顆粒。圖4不同溫度煅燒HA粉末的TEM照片,(a)750℃,(b)900℃(a)(b)第12頁/共34頁（二）制備球形羥基磷灰石的新方法1.復(fù)合球形羥基磷灰石2.直接合成球形羥基磷灰石第13頁/共34頁Ca化合物P化合物微晶生成復(fù)合成球Ca化合物P化合物微球生成晶形轉(zhuǎn)化薄殼球形HAP球形HAP第14頁/共34頁HAP的色譜機(jī)理是一種弱離子交換色譜,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)DNA、多肽、蛋白質(zhì)的分離機(jī)理合乎離子交換色譜的機(jī)理。HAP的色譜機(jī)理可能包括以下幾個(gè)方面:存在兩種不同的吸附晶面;兩種不同晶面吸附方式不同;兩種不同吸附點(diǎn)的起因:Ca2+離子和PO43-;色譜歷程為離子間的競(jìng)爭(zhēng)過程。第15頁/共34頁HAP在生化產(chǎn)物分離中的應(yīng)用一般應(yīng)用領(lǐng)域:糖類,多肽,蛋白質(zhì),酶,核糖核酸。單克隆抗體的分離純化。結(jié)構(gòu)差異很小的蛋白質(zhì)分離。第16頁/共34頁問題HAP是什么原理的色譜?為什么HAP具有比較高的分辯力?HAP色譜填料的主要特點(diǎn)?第17頁/共34頁第十三章徑向色譜柱的發(fā)展與應(yīng)用第18頁/共34頁傳統(tǒng)色譜存在的問題放大過程的困難；保證生物物質(zhì)活性的困難：生物樣品的分離純化過程對(duì)環(huán)境的要求較嚴(yán)，生物組成成分復(fù)雜，分子量較大，比較敏感，增加其使用的難度；生產(chǎn)效率的問題。第19頁/共34頁什么是徑向色譜采用徑向流技術(shù)的色譜,即樣品和流動(dòng)相沿徑向流動(dòng),可以從色譜柱的周圍流向圓心,也可以從圓心流向柱的周圍,通常采用從柱的周圍流向圓心的方式。第20頁/共34頁徑向色譜技術(shù)的發(fā)展可以追溯到五十年以前,1947年發(fā)明的借助離心力分離溶液的裝置,已經(jīng)采用了徑向色譜的原理和方法。第21頁/共34頁徑向色譜的優(yōu)點(diǎn)采用徑向流技術(shù),可以在較小的柱床層高度時(shí)使用較大的流動(dòng)相速度。在較高流動(dòng)相速度時(shí),反壓降低?？梢跃€性地增加樣品處理量,樣品可以在完全相同的色譜條件下直接放大。第22頁/共34頁徑向色譜柱分離介質(zhì)目前徑向色譜柱使用的填料主要有離子交換樹脂和親和色譜兩種。離子交換色譜使用率最高,其中以二乙基氨基已基(DEAE)為官能團(tuán)的使用最多,其次為羥甲基(CM)和磷酸(P)。選擇具高選擇的填料可以克服徑向色譜直徑短的缺點(diǎn),發(fā)揮徑向色譜柱速度快,處理量大的優(yōu)點(diǎn)。第23頁/共34頁幾種徑向色譜填料形態(tài)(顆粒,膜,連續(xù)床層)1、膜填料:通過接枝聚合反應(yīng)獲得的填料再制成膜狀,卷入事先設(shè)計(jì)好的色譜柱中,使成為徑向色譜柱。常用：多糖類基質(zhì)上通過接枝聚合反應(yīng)，以化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合上有機(jī)聚合物，形成一部分具有穩(wěn)定的共價(jià)性結(jié)構(gòu)，另一部分則是較軟的聚合物的產(chǎn)物。第24頁/共34頁2、連續(xù)床層填料:連續(xù)床層填料為一整體,其橫截面有足夠的通道容許流動(dòng)相和樣品通過色譜柱床層。連續(xù)床孔隙度高,滲透性好,因此適合在高流速下進(jìn)行分析分離而不會(huì)導(dǎo)致過高的反壓。第25頁/共34頁徑向色譜的傳質(zhì)過程軸心向柱外圍及柱外圍向軸心的傳質(zhì)過程有差別。徑向色譜與軸向色譜在傳質(zhì)機(jī)制上的不同其中主要原因之一是分子擴(kuò)散的問題,分子擴(kuò)散可以忽略的情況下二者傳質(zhì)存在對(duì)稱性,以體積坐標(biāo)表達(dá)的方程式完全相同,分子擴(kuò)散不可忽略時(shí)二者不存在這種對(duì)應(yīng)關(guān)系。第26頁/共34頁徑向色譜的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：處理量、線性放大。

中試規(guī)模徑向柱與軸向柱經(jīng)濟(jì)性比較相同生產(chǎn)規(guī)模的徑向柱與軸向柱的比較

軸向柱與徑向柱分離凝血?jiǎng)┑幕厥章时容^項(xiàng)目軸向柱徑向柱流速25L/h75-95L/h產(chǎn)率350L/3班350L/班柱尺寸16L20L項(xiàng)目軸向柱徑向柱流速200L/h200L/h產(chǎn)率1000L/3班1000L/班柱尺寸160L60L色譜模式柱體積上樣流速柱流速抽提蛋白量抽提活性回收活性產(chǎn)率軸向柱756017605.12.549.0徑向柱4001203383225.815.861.0第27頁/共34頁徑向色譜的應(yīng)用進(jìn)行人血漿的大規(guī)模分離制備（免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白）。分離小牛血清（牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白）。純化鼠抗人尿激酶單克隆抗體。純化登革病毒單克隆抗體和乙肝核心抗原單克隆抗體。純化重組人白細(xì)胞介素－2和－干擾素。第28頁/共34頁問題什么叫徑向色譜?