生物化工產(chǎn)品的開發(fā)及生產(chǎn)技術(shù)2

生物化工產(chǎn)品的開發(fā)及生產(chǎn)技術(shù)2第1頁/共205頁有機酸氨基酸生物可降解塑料功能性食品添加劑生物農(nóng)藥與生物肥料生物藥物及其他生物產(chǎn)品第2頁/共205頁1、檸檬酸：檸檬酸(“枸椽酸”)：第一有機酸，2008年全球檸檬酸總銷量高達(dá)115萬噸，食品用途約占6成，醫(yī)藥和其它工業(yè)用途（化妝品，洗滌劑等）約占4成。我國是世界主要檸檬酸生產(chǎn)國與出口國，出口量高達(dá)15萬噸以上。

第一節(jié)有機酸一、重要的有機酸第3頁/共205頁

國內(nèi)主要生產(chǎn)商有蚌埠豐源集團、無錫中亞羅氏公司以及青島扶?；瘜W(xué)公司等。其總產(chǎn)量即達(dá)20萬噸左右。墨西哥、日本和美國的生產(chǎn)企業(yè)相繼關(guān)閉其檸檬酸生產(chǎn)線，我國檸檬酸將在國際市場上占主導(dǎo)地位。檸檬酸的產(chǎn)品主要是：無水檸檬酸、一水檸檬酸、檸檬酸鈉鹽、檸檬酸鉀鹽、檸檬酸鋁鹽、檸檬酸胺鹽。第4頁/共205頁檸檬酸的消費領(lǐng)域：飲料行業(yè)占40～45％食品添加劑等占15～20％洗滌劑占20～30％醫(yī)藥占5％其它占10％第5頁/共205頁具有廣泛用途的有機酸。世界乳酸的總產(chǎn)量約為20萬噸左右，日本和美國兩國的乳酸需求量3.5萬噸。我國的乳酸目前已形成了約4萬噸的生產(chǎn)能力。青島扶桑化學(xué)公司是國內(nèi)最大的精制(發(fā)酵)乳酸出口企業(yè)。

2、乳酸——聚乳酸牽頭發(fā)展第6頁/共205頁

PLA為一種無毒高分子新材料，在環(huán)境中可自動降解，可用于生產(chǎn)醫(yī)用塑料制品和食品包裝等。產(chǎn)業(yè)界認(rèn)定為新世紀(jì)最有發(fā)展前途的新型材料。由于我國原料玉米豐富，發(fā)展乳酸及聚乳酸產(chǎn)業(yè)的前景廣闊。目前，乳酸生產(chǎn)成本偏高以及聚乳酸聚合難題成為制約乳酸工業(yè)發(fā)展的瓶頸。

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發(fā)酵法生產(chǎn)的乳酸有L－乳酸和D－乳酸。我國用德氏桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)的乳酸96％為D型，L型只有4％?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)的乳酸D型和L型個50％。稱DL乳酸。第8頁/共205頁蘋果酸在飲料中使用較多。但由于價格較貴，故蘋果酸的用途受到了一定的限制。全球蘋果酸的年產(chǎn)銷量約在3萬噸左右。蘋果酸有清除牙齒色斑和牙垢(牙石)的美容作用。故日本花王等日化產(chǎn)品廠商均已在牙膏、牙粉等潔齒產(chǎn)品中添加蘋果酸。3、蘋果酸——生產(chǎn)成本較高第9頁/共205頁

而L蘋果酸可用于醫(yī)藥工業(yè)的輸液、pH調(diào)節(jié)劑和某些藥物的中間體。每噸純品65－70萬元人民幣。生產(chǎn)成本高,出口數(shù)量少。我國采用固定化菌體將富馬酸轉(zhuǎn)化為L蘋果酸，因技術(shù)不過關(guān)，富馬酸殘留高，出口困難。而發(fā)酵法生產(chǎn)L－蘋果酸仍處于研究階段。第10頁/共205頁葡糖酸是唯一具有促進雙歧桿菌等“益生菌”生長作用的有機酸。蜂蜜、釀造醋等產(chǎn)品均含有一定量的天然葡糖酸。酸味為檸檬酸的1/3。葡糖酸作為食品和醫(yī)藥原料(如用于生產(chǎn)“葡糖酸鈣)的用量正在逐年上升。4、葡糖酸——有保健新用途第11頁/共205頁

全球葡糖酸的產(chǎn)銷量約在2萬噸左右，其中90%用于食品加工(如作為豆腐凝固劑)，用于醫(yī)藥的僅占1成。主要產(chǎn)品葡萄糖酸、葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸δ－內(nèi)酯,其次，葡萄糖酸的鈣、鈉、銨、鐵等鹽類廣泛地用于醫(yī)藥、食品、紡織、皮革等工業(yè)上。第12頁/共205頁

主要來源是葡萄酒生產(chǎn)廠。酒石酸在食品工業(yè)中應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如檸檬酸那樣廣泛，但它卻是醫(yī)藥工業(yè)的重要原料。許多難溶藥物均可加工成為水溶性極佳的酒石酸鹽(如經(jīng)典藥物“酒石酸銻鉀”)。歐洲各大葡萄酒廠是世界最大的酒石酸生產(chǎn)基地，全球80%的酒石酸產(chǎn)自歐洲。發(fā)酵法生產(chǎn)酒石酸仍在研究中。5、酒石酸——八成產(chǎn)自歐洲第13頁/共205頁琥珀酸在食品工業(yè)中應(yīng)用較少，也屬醫(yī)藥工業(yè)的常用原料之一。主要用于生產(chǎn)難溶藥物的水溶性鹽——琥珀酸鹽。全球琥珀酸總產(chǎn)銷量約在1萬-2萬噸左右。我國的琥珀酸生產(chǎn)仍以化學(xué)合成為主。未見發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的報道。6、琥珀酸——產(chǎn)量不大第14頁/共205頁

重要的化工原料，主要用于晴綸化纖、樹脂、橡膠、涂料、造紙、制藥、農(nóng)藥、輕工、食品等領(lǐng)域（合成樹脂或在工業(yè)上用作除垢劑等）。世界年需衣康酸5－6萬噸。主要生產(chǎn)國美國、日本、俄羅斯。我國以發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸，年產(chǎn)量5000t。大部分內(nèi)銷。因技術(shù)存在問題，產(chǎn)品質(zhì)量不過關(guān)。外銷困難。7、衣康酸第15頁/共205頁常見有機酸發(fā)酵生產(chǎn)菌種檸檬酸Aspergillusniger（黑曲霉）葡萄糖酸Aspergillusniger（黑曲霉）醋酸Acetobacteraceti（醋化醋桿菌）乳酸Lactobacilusdelbrackii（德氏乳桿菌）-酮戊二酸Candidasp.（一種假絲酵母）衣康酸等Aspergillusterreus（土曲霉）水楊酸Pseudomonasaeruginosa（銅綠假單胞菌）丙酸Propionibacteriumshermanii(謝氏丙酸桿菌)第16頁/共205頁檸檬酸（citricacid）又名枸櫞酸，學(xué)名3-羥基-3-羧基戊二酸(C6H8O7)是生物體代謝產(chǎn)物之一，廣泛分布于自然界、動物及人的器官中。無色透明或半透明晶體，或粒狀、微粒狀粉末，無臭，具有強烈的酸味，但令人愉快。稍有澀味。極易溶于水，乙醇，微溶于乙醚。無旋光性。

二檸檬酸的發(fā)酵生產(chǎn)HOOCCH2CHOHCOOHCH2COOH(一)、概述第17頁/共205頁（1）食品方面：檸檬酸被稱為第一食用酸味劑飲料——不僅賦予飲料水果風(fēng)味，而且具有增溶、緩沖、抗氧化等作用，能是飲料中的糖、香精、色素等成分交融協(xié)調(diào)果醬和果凍，釀造酒，冰激淋和人造奶油（增加乳化穩(wěn)定性）、腌制品（除腥去臭、抗氧化）、罐頭食品、豆制品和調(diào)味品

1、檸檬酸的應(yīng)用第18頁/共205頁

（2）醫(yī)藥工業(yè)、美容、化妝品工業(yè)中作為活性藥物的增溶劑，改善藥物口感和清涼，解毒功能。洗發(fā)和染發(fā)劑中均有檸檬酸具有防腐，去除頭皮屑功能，洗頭時可增加頭發(fā)的光澤，恢復(fù)頭發(fā)的彈性。

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（3）金屬工業(yè)中作為凈化劑，可去除有色金屬表面的氧化物。在洗衣粉中作為去垢劑，作為磷酸鹽的替代用品。電鍍工業(yè)中作為電鍍緩沖劑和絡(luò)合劑、治理工業(yè)廢氣中用于回收SO2等等第20頁/共205頁1784年;由Scheels氏發(fā)現(xiàn)檸檬酸

1893年至1917年：青霉菌生產(chǎn)（德國微生物學(xué)者Wehmer首先用青霉菌生產(chǎn)檸檬酸）；1917年至1938年：黑曲霉，淺盤發(fā)酵，奠定了大規(guī)模生產(chǎn)的基礎(chǔ)；1938年至1951年：深層發(fā)酵，用糖蜜為原料（1951年美國Miles公司首先采用深層發(fā)酵法）。2、國外檸檬酸發(fā)酵技術(shù)發(fā)展的三個歷史時期第21頁/共205頁我國在20世紀(jì)40年代初開始淺盤發(fā)酵；60年代末開始深層發(fā)酵（先為薯干原料，后發(fā)展到精淀粉或糖蜜原料）；1970年開始進行石油為原料發(fā)酵檸檬酸(C10～22鏈烷烴等）目前，我國檸檬酸生產(chǎn)廠已過百家，年生產(chǎn)能力達(dá)80多萬噸，居世界第一位。第22頁/共205頁

淀粉質(zhì)原料或糖質(zhì)原料：

黑曲霉（Aspergillusniger）

正烷烴為原料：解脂假絲酵母（Candidalipolytica）熱帶假絲酵母（C.tropicalis）(二)、檸檬酸生產(chǎn)菌第23頁/共205頁(三)、檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)方法對于典型的好氧發(fā)酵，工業(yè)上的生產(chǎn)方法：-液體表面發(fā)酵法-固態(tài)發(fā)酵法-液態(tài)深層發(fā)酵法——

利用液體中的溶解氧利用氣相中的氧第24頁/共205頁1、簡介：將接種后的發(fā)酵液分裝入發(fā)酵盤進行發(fā)酵的方法。傳統(tǒng)方法，設(shè)備投資少，動力消耗低，原料粗放、價廉，生產(chǎn)易控制，目前已實現(xiàn)全部自動化操作。缺點是設(shè)備占地大，勞動強度大，能耗高，產(chǎn)率和回收率低，副產(chǎn)物多。(四)、檸檬酸的靜止淺盤發(fā)酵工藝第25頁/共205頁2、淺盤發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵盤：材質(zhì)，以不銹鋼為佳。規(guī)格4m×1.2m×0.15m。其次還有鐵盤、鋁盤、耐酸塑料盤。發(fā)酵盤經(jīng)常受到酸液、高溫蒸汽、甲醛、微生物的侵蝕，所以材料和涂料要求嚴(yán)格。為了防止蒸發(fā)過快和天花板冷凝水滴入盤中，每個發(fā)酵盤上有一盤罩第26頁/共205頁3、發(fā)酵室：具有良好的通風(fēng)系統(tǒng)，保證溫度、濕度和風(fēng)量能滿足不同階段的發(fā)酵要求，并且保證無菌。每個發(fā)酵室裝兩排發(fā)酵架，每架放10個發(fā)酵盤。發(fā)酵架連接通風(fēng)管道、排風(fēng)管道和進料，出料管道，接種噴霧管道。第27頁/共205頁（1）目的：獲取大量高質(zhì)量的分生孢子（孢子或干孢子），所以又稱為“干孢子生產(chǎn)”。對孢子的質(zhì)量要求：

–

形態(tài)整齊均一，無雜菌混入，發(fā)芽率高，發(fā)芽后生長速率適當(dāng)，產(chǎn)酸活力高，無退化現(xiàn)象。黑曲霉的擴大培養(yǎng)一般經(jīng)過三個階段，相應(yīng)的階段依次稱為一級、二級、和三級種子培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)的工藝流程和各級的培養(yǎng)方法因地而異，按照最終成品的形式可以區(qū)分為麩曲生產(chǎn)和孢子生產(chǎn)。4、菌種的擴大培養(yǎng)第28頁/共205頁5、干孢子制備工藝流程：一級發(fā)酵用種子質(zhì)量鑒定培養(yǎng)器液態(tài)培養(yǎng)32－35℃干孢子收集干燥40－50℃無菌空氣成品保藏使用前檢查斜面培養(yǎng)30℃原菌種三角瓶培養(yǎng)3二級三級第29頁/共205頁（總發(fā)酵時間：8～9天）6、液體表面發(fā)酵工藝流程pH值3～4.5攪拌煮沸15～30min靜止4h取上清加等體積沸水，糖蜜質(zhì)量1%生石灰糖蜜原料硫酸或硫酸鈉糖蜜濃度12～16%（以蔗糖計）冷卻至60～70℃加營養(yǎng)鹽和抗菌劑入室裝盤（40～45℃液層深8～20㎝）冷卻至35℃接種黑曲霉干孢子（100mg/m2表面積）通風(fēng)培養(yǎng)（35℃，3天）控溫發(fā)酵至結(jié)束26～28℃，pH2.5最大通風(fēng)量(15～18m3/m2·h，濕度75%以上)第30頁/共205頁(五)、檸檬酸的深層發(fā)酵工藝第31頁/共205頁1檸檬酸發(fā)酵的原料原料糖質(zhì)原料和石油烷烴。糖質(zhì)原料包括薯類：甘薯、薯干、木薯、木薯干、馬鈴薯、薯渣。谷類：玉米、小麥、面粉、大米。淀粉：谷類與薯類加工的淀粉。砂糖：白砂糖、赤砂糖、糖蜜。

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淀粉糖：淀粉水解糖(單糖、雙糖、糊精、葡萄糖母液)果實，糧食加工下腳料：各種含糖果實、糖食加工的下腳料等。石油烷烴原料包括正烷烴、乙酸、乙醇等第33頁/共205頁淀粉水解糖的制備

淀粉質(zhì)原料是發(fā)酵工業(yè)常用的原料，大多數(shù)發(fā)酵生產(chǎn)菌不能直接利用或僅微弱利用淀粉，因此淀粉質(zhì)原料必須轉(zhuǎn)化為葡萄糖等可發(fā)酵性糖，才能被生產(chǎn)菌利用。工業(yè)生產(chǎn)將淀粉水解為葡萄糖的過程稱為淀粉的糖化，所制得的糖液稱為淀粉水解糖第34頁/共205頁碳源：黑曲霉能利用的碳源很多，淀粉和二糖，單糖大多能利用。從生產(chǎn)角度看，葡萄糖、蔗糖、糊精是最好的碳源。但為了降低成本，多用廉價的甘薯、玉米、小麥及其淀粉、糖蜜。高糖濃度是檸檬酸深層發(fā)酵的特征，薯干粉深層發(fā)酵，粉漿濃度可達(dá)16－20％。淀粉質(zhì)粉漿濃度25%。2培養(yǎng)基第35頁/共205頁生理酸性氮:（NH4)2SO4,（NH4)3PO4（NH4)2HPO4（NH4)Cl（NH4)2CO3生理堿性氮:NaNO3,KNO3LiNO3CaNO3

有機氮:麩皮、米糠、蛋白胨、氨基酸、尿素等。氮源：檸檬酸發(fā)酵中的氮源有第36頁/共205頁氮源是黑曲霉合成細(xì)胞物質(zhì)和代謝調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，特別是細(xì)胞中銨離子濃度的升高，能解除ATP和檸檬酸對磷酸果糖激酶的反饋抑制，有利于檸檬酸的生成與積累。在檸檬酸生產(chǎn)中，黑曲霉偏好生理酸性氮[如（NH4)2SO4]，酸性氮中的銨離子被利用后，使培養(yǎng)基變酸，可以使發(fā)酵中的黑曲霉生長階段結(jié)束，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸階段，pH下降到較低水平有利于檸檬酸的積累，所以銨鹽即可以調(diào)節(jié)代謝，也可以控制pH。第37頁/共205頁無機鹽：無機鹽是黑曲霉生長和檸檬酸發(fā)酵不可缺少的物質(zhì)，具有構(gòu)成菌體，促進代謝，促進產(chǎn)酸的作用。我國采用誘變方法改良的菌株耐金屬離子，原料與水可不經(jīng)處理用于發(fā)酵。采用薯干粉、馬鈴薯、木薯和糖蜜原料發(fā)酵，其中P、K、Mg、S已夠黑曲霉生長，不需專門添加。第38頁/共205頁要求KH2PO4KClMgSO4.7H2OZn2＋Mn2＋Cu2＋SFe2＋％％％mg/L深層0.05-0.5

0.01-0.030.01-0.05

<0.3<0.2<0.5<0.07<0.2

發(fā)酵黑曲霉對無機鹽及微量元素的要求第39頁/共205頁鏡檢：菌絲粗壯，結(jié)成菊花狀小球體，無異味，無雜菌。pH：2.0-2.5酸度：0.5-2.0%檸檬酸含量：0.5g/dl種子質(zhì)量要求：第40頁/共205頁3檸檬酸深層發(fā)酵工藝流程（薯干原料）原始菌種實罐滅菌預(yù)處理培養(yǎng)基配制原料實罐液化粉碎無菌空氣麩曲菌種空氣凈化系統(tǒng)空壓機種子罐試管斜面環(huán)境空氣過濾發(fā)酵連消發(fā)酵成熟醪去檸檬酸提取工段代表菌種：Co827、γ-130、T419第41頁/共205頁

液體深層發(fā)酵工藝三級過濾↓黑曲霉↓原料,配料↓滅菌空氣ⅠⅡⅢ無菌空氣檸檬酸（鹽）ⅣⅤ第42頁/共205頁無菌空氣制備和有氧發(fā)酵系統(tǒng)（氣升式發(fā)酵罐）第43頁/共205頁生產(chǎn)實例工藝說明菌種：Co827麩曲菌種：制法同前種子罐培養(yǎng)基：干薯干粉16-20%，（NH4)2SO40.5%，0.1MPa蒸汽滅菌30min，接入1000ml三角瓶麩曲菌種20-50只（根據(jù)發(fā)酵罐容積定）。35±1℃培養(yǎng)16-24h。發(fā)酵罐培養(yǎng)基：干薯干粉16-20%，0.1%的α-淀粉酶（中溫），115℃滅菌10－15min，培養(yǎng)溫度35±1℃，通風(fēng)量0.08-0.15m3/m3.min（視接種方式及培養(yǎng)情況而定）。第44頁/共205頁溫度控制黑曲霉屬嗜熱菌，最適生長溫度33－37℃，生產(chǎn)中溫度控制在35±1℃。若采用孢子接種，在孢子發(fā)芽和菌球體形成階段，可采用40℃高溫培養(yǎng)，促進其發(fā)育，進入產(chǎn)酸期再降到35℃左右。pH控制黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌發(fā)育適宜pH3－7。一般在生產(chǎn)中，在菌種生長期，pH維持在4.5(有利于糖化）。而檸檬酸積累時，即產(chǎn)酸期最適pH2.0-3.0。pH3.0以上易產(chǎn)生草酸。采用薯干發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，初始pH不調(diào)節(jié)，為自然pH。第45頁/共205頁接種量孢子接種量與產(chǎn)酸的速率成正比關(guān)系，隨著孢子接種量的增加，檸檬酸的產(chǎn)率也提高。溶解氧的控制黑曲霉的檸檬酸產(chǎn)生菌屬于嚴(yán)格的好氧菌，在生長、繁殖和產(chǎn)酸階段均需要氧，一般黑曲霉生長期溶氧分壓＞1.8kPa，產(chǎn)酸期溶氧分壓＞3.2kPa第46頁/共205頁由于菌體生長過程中呼吸作用，消耗大量的氧氣，特別當(dāng)菌體生長接近最大值時(20～24h)即旺盛的對數(shù)生長期時，其需氧達(dá)到最高蜂，其后(一般24—30h)菌體生長緩慢，進入產(chǎn)酸期，氧的消耗率立即降低到一個較低的水平，并一直持續(xù)到發(fā)酵終了。第47頁/共205頁(六）檸檬酸生產(chǎn)下游工程

成熟的檸檬酸發(fā)酵醪，主要成分除檸檬酸，還有菌體，纖維、有機雜酸、糖、蛋白類膠體物質(zhì)、色素、礦物質(zhì)及其它代謝產(chǎn)物。來源于原料及發(fā)酵過程中。以溶解或懸浮狀存在于發(fā)酵醪中。通過各種理化方法，清除這些雜質(zhì)，得到符合各級質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸成品的全過程，即為檸檬酸生產(chǎn)的下游工程。第48頁/共205頁發(fā)酵醪精濾凈化液復(fù)濾過濾陽離子交換拄調(diào)漿粗檸檬酸液預(yù)熱鈣鹽離子交換工藝流程活性碳粒濾液酸解蒸發(fā)結(jié)晶離心陰離子交換拄預(yù)處理復(fù)濾過濾洗鈣中和過濾濕晶包裝干燥筒倉篩分入庫成品菌渣濃有機廢水淡有機廢水濕石膏渣加熱90℃CaCO390℃H2SO4等外品洗晶水母液70℃第49頁/共205頁

乳酸,又名丙醇酸,學(xué)名α-羥基丙酸,分子式為C3H6O3,其分子結(jié)構(gòu)中含有一個不對稱碳原子,因此具有旋光性按其構(gòu)型及旋光性可分為L-乳酸、D-乳酸和DL外消旋乳酸三類.它是世界上公認(rèn)的三大有機酸之一,是制造無毒的高分子化合物聚L-乳酸的單體,也是醫(yī)藥、印刷、印染、制革、食品等工業(yè)的重要原料。二乳酸發(fā)酵第50頁/共205頁

乳酸,又名丙醇酸,學(xué)名α-羥基丙酸,分子式為C3H6O3,其分子結(jié)構(gòu)中含有一個不對稱碳原子,因此具有旋光性按其構(gòu)型及旋光性可分為L-乳酸、D-乳酸和DL外消旋乳酸三類.它是世界上公認(rèn)的三大有機酸之一,是制造無毒的高分子化合物聚L-乳酸的單體,也是醫(yī)藥、印刷、印染、制革、食品等工業(yè)的重要原料。二乳酸發(fā)酵第51頁/共205頁

作為一種食品添加劑人體只含有L-乳酸脫氫酶,所以只能夠分解自身產(chǎn)生或攝入的L-乳酸,所以高光學(xué)純度的L-乳酸更受市場的青睞。自然界中可產(chǎn)生L-乳酸的微生物很多,但產(chǎn)酸能力強,可應(yīng)用到工業(yè)上的只有霉菌中的根霉及細(xì)菌的乳桿菌屬、鏈球菌屬及芽孢桿菌屬,下表列出了一些主要的產(chǎn)L-乳酸的微生物。第52頁/共205頁第53頁/共205頁

根霉屬(Rhizopus)中產(chǎn)L一乳酸的菌種很多,有米根霉(Rhizopusoryzae)、黑根霉(Rhizopusnigricans)、華根霉(Rh.chinensis)、行走根霉(Rhizopusstolonifer)、小麥曲根霉(Rhizopusritici)和美麗根霉(Rhizopuselegans)等十多種,其中米根霉生產(chǎn)L一乳酸的能力最強。

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米根霉菌落疏松或稠密,最初呈白色,后變?yōu)榛液稚蚝诤稚?。菌絲爬行,無色,于37-40℃生長。米根霉能夠利用淀粉等廉價原料,營養(yǎng)要求粗放,菌絲體大而易于分離,利于L一乳酸的精制,成為國內(nèi)外廣泛研究的發(fā)酵生產(chǎn)菌。第55頁/共205頁第56頁/共205頁

國內(nèi)外對乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的研究,主要是從發(fā)酵原料的選擇、菌種的選擇和改良、發(fā)酵工藝技術(shù)的改進三個方面進行的第57頁/共205頁（一）發(fā)酵制備L-乳酸所用的原料及選擇

1發(fā)酵制備L-乳酸所用原料的種類目前國內(nèi)外發(fā)酵制備乳酸所用原料多集中于農(nóng)副產(chǎn)品，也有利用纖維等廢棄物發(fā)酵乳酸的報道。

以玉米淀粉或玉米粉發(fā)酵制備乳酸；以大米粉發(fā)酵制備乳酸；以紅薯淀粉發(fā)酵制備乳酸；以纖維等廢棄物發(fā)酵制備乳酸；以廢食品等為碳源進行乳酸制備。第58頁/共205頁第59頁/共205頁

YuRC等人對直接發(fā)酵農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)L-乳酸進行了研究，其結(jié)果是每千克粗玉米淀粉原料生成350g以上的L-乳酸。白冬梅等人對玉米淀粉先液化糖化再進行發(fā)酵，產(chǎn)酸71.65g/L。吳清林等人直接對玉米粉進行發(fā)酵，通過物理方法處理，克服了淀粉濃度過高時基質(zhì)變?yōu)槟z而不能發(fā)酵的困難，不需經(jīng)液化糖化程序。第60頁/共205頁

發(fā)酵制備乳酸的發(fā)展方向是對淀粉質(zhì)原料的直接應(yīng)用，不需經(jīng)過液化和糖化，這樣可以大大簡化工序、降低成本，為實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。另一發(fā)展方向就是利用低品位的原料(如生物質(zhì)原料、廢纖維、廚房垃圾等)發(fā)酵制備乳酸，以實現(xiàn)資源循環(huán)利用和可持續(xù)利用。第61頁/共205頁發(fā)酵制備L-乳酸原料的利用方式

發(fā)酵制備L-乳酸原料利用方式的不同決定整個工藝的進程，影響生產(chǎn)的成本。目前發(fā)酵制備L-乳酸對原料的利用方式主要集中于：①先經(jīng)液化再糖化，進而再經(jīng)微生物利用；

②糖化和發(fā)酵同時進行；

③對淀粉質(zhì)原料直接進行利用，不經(jīng)過液化糖化處理，可簡化工藝過程，但對菌種要求較高，目前產(chǎn)率較低。第62頁/共205頁（二）菌種的選擇和改良

菌種選育菌種的優(yōu)良直接關(guān)系到發(fā)酵過程的控制及其產(chǎn)量等,是發(fā)酵過程中的一個至關(guān)重要的影響因素。目前以米根霉為親本的優(yōu)良菌株的選育有:第63頁/共205頁1、常規(guī)誘變育種第64頁/共205頁丙烯醇的YPD平板篩選：只有乙醇脫氫酶（ADH）活性減弱的菌株才能生長。抑制ADH活性，降低丙酮酸向乙醇支路的轉(zhuǎn)化，可能會提高丙酮酸向乳酸支路的碳流。

發(fā)酵復(fù)篩，得到最優(yōu)突變株：取原始菌株、初篩后的突變菌株進行初步發(fā)酵。測定乳酸產(chǎn)量，選擇出乳酸高產(chǎn)突變株。

第65頁/共205頁育種實驗方案流程：第66頁/共205頁2、離子注入誘變育種

離子注入生物體誘變育種是人工誘變方法的一種新發(fā)明,已經(jīng)證實離子注入誘變,可以獲得高突變率,擴大突變譜,為篩選優(yōu)良的突變型菌株提供廣闊的空間。

第67頁/共205頁

低能離子注入：樣品的制備：長好的新鮮斜面,用7～10mL生理鹽水洗下斜面孢子,用雙層無菌紗布過濾得到無菌絲體孢子懸液,取稀釋10倍孢子懸液0.1mL均勻涂布于無菌平皿風(fēng)干。第68頁/共205頁低能離子誘變處理：

一般采用N+，能量為10keV~15keV，需要采用不同的劑量去處理。樣品、稀釋、分離、培養(yǎng)及篩選：

1mL生理鹽水洗滌注入后的樣品,將洗脫液稀釋到10-2～10-3

，取0.05mL涂布于溴甲酚綠平板或琥珀酸平板上，34～36℃培養(yǎng)，挑取單菌落進行初篩，復(fù)篩。第69頁/共205頁

古紹彬、葛春梅等采用離子束誘變方法,對米根霉PW352進行改良,以葡萄糖為碳源獲得高產(chǎn)L(+)-乳酸菌株RE3303,產(chǎn)酸能力達(dá)131～136g/L,最高可達(dá)140g/L,糖轉(zhuǎn)化率為86%～90%,產(chǎn)酸比PW352提高75%。

第70頁/共205頁

楊英歌、李文等采用氮離子注入誘變方法，對出發(fā)菌株米根霉RLC41-6進行改良，獲得高產(chǎn)L(+)-乳酸菌RQ4012，以木糖作為碳源，發(fā)酵周期為72h，產(chǎn)酸能力達(dá)74.37g/L，產(chǎn)酸速達(dá)1.03g/(L.h)，比RLC41-6提高了1.6倍。經(jīng)過多次傳代實驗證明該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。第71頁/共205頁

李市場、葛春梅等采用離子修飾技術(shù)對一株產(chǎn)L-乳酸的米根霉菌P988進行誘變處理,從正變菌株中反復(fù)篩選,得到一株產(chǎn)酸量高的菌株P(guān)N2207,產(chǎn)酸量達(dá)110g/L,比出發(fā)菌株提高了23%,經(jīng)過連續(xù)傳代試驗,其遺傳性狀穩(wěn)定。第72頁/共205頁

3.利用基因工程技術(shù)得到高產(chǎn)的目的工程菌株。

L-乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase)以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+/NADH作輔酶,可逆催化氧化L-乳酸生成丙酮酸,因此可以提高L-乳酸脫氫酶表達(dá)基因在菌株中的擴增,使其向有利于L-乳酸生成的方向進行。

Skory首次將米根霉的乳酸脫氫酶基因在酵母菌中表達(dá)。其后又通過提高乳酸脫氫酶活性來提高米根霉的產(chǎn)酸能力。盡管基因工程實現(xiàn)了有目的、有控制的菌株選育,但目前關(guān)于插入的DNA片斷在米根霉菌株中是如何結(jié)合與復(fù)制的還不清楚,在如何選擇最佳質(zhì)粒載體等方面也還有待進一步的研究。第73頁/共205頁

根霉發(fā)酵機理

L-乳酸發(fā)酵按發(fā)酵過程中生成產(chǎn)物的不同,可分成同型發(fā)酵及異型發(fā)酵兩類,不同菌種有不同的乳酸發(fā)酵機理,細(xì)菌發(fā)酵為厭氧或微好氧。細(xì)菌的同型發(fā)酵一般是通過糖酵解途徑,異型發(fā)酵有6-磷酸葡萄糖酸途徑和雙歧途徑兩種。根霉發(fā)酵屬好氧異型發(fā)酵,但其途徑與細(xì)菌異型發(fā)酵不同,是通過糖酵解途徑,發(fā)酵產(chǎn)生L-乳酸的同時產(chǎn)生乙醇、富馬酸等,糖轉(zhuǎn)化率較低。（三）發(fā)酵工藝技術(shù)第74頁/共205頁同型乳酸發(fā)酵是葡萄糖經(jīng)直接酵解途徑降解為丙酮酸,丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下還原為乳酸。此發(fā)酵過程中,1mol葡萄糖可以生成2mol乳酸,理論轉(zhuǎn)化為100%。第75頁/共205頁

異型乳酸發(fā)酵是某些乳酸細(xì)菌利用磷酸已糖途經(jīng)(HMP途徑),分解葡萄糖為6-磷酸核酮酸,再經(jīng)差向異構(gòu)酶作用變成5-磷酸木酮糖,然后經(jīng)磷酸酮解酶催化裂解反應(yīng),生成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。磷酸酮解酶是異型乳酸發(fā)酵的關(guān)鍵酶。乙酰磷酸進一步還原為乙醇,同時放出磷酸。而3-磷酸甘油醛經(jīng)EMP途徑后半部分轉(zhuǎn)化為乳酸,同時產(chǎn)生兩分子ATP?？鄢l(fā)酵時激活葡萄糖消耗的1分子ATP,凈得1分子ATP。因此由葡萄糖進行異型乳酸發(fā)酵,其產(chǎn)酸能力比同型乳酸發(fā)酵低一半。異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)物除乳酸外還有乙醇、CO2

和ATP。第76頁/共205頁第77頁/共205頁

雙歧發(fā)酵是兩歧雙岐桿菌(Bifidobacteriumbi2fidum)發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸的一條途徑。其發(fā)酵途徑如下:第78頁/共205頁乳酸生產(chǎn)的傳統(tǒng)方法是采用游離細(xì)胞在攪拌罐中進行發(fā)酵，由于米根霉的菌絲發(fā)達(dá)，在罐中易形成大的菌絲團，引起氧氣及其它營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞困難，或纏繞在攪拌槳上，使攪拌阻力增加，造成產(chǎn)酸速率低、得率低、生產(chǎn)不穩(wěn)定等問題。Cachon和Divies的研究表明固定化技術(shù)可以作為一種穩(wěn)定菌體活力、防止質(zhì)粒流失的工具。因此利用固定化技術(shù)生產(chǎn)乳酸可以提高細(xì)胞濃度和乳酸產(chǎn)率。米根霉發(fā)酵工藝第79頁/共205頁

在工業(yè)化生產(chǎn)中最重要的是：固定化細(xì)胞載體可以反復(fù)使用，盡量減少接種次數(shù)，節(jié)省了大量的人力、物力和能源。因此，固定化技術(shù)是提高生物催化劑利用率、生物反應(yīng)速率以及實現(xiàn)高效連續(xù)生產(chǎn)過程的有效方法。用于米根霉固定化發(fā)酵的載體種類相對比較多，但是很少能優(yōu)化出用于大規(guī)模生產(chǎn)并創(chuàng)造出良好的經(jīng)濟效益的載體規(guī)格，所以在以后對于乳酸固定化發(fā)酵的研究中，載體的優(yōu)化和改良必將成為新的研究熱點。第80頁/共205頁

理想的固定化細(xì)胞載體應(yīng)該是：對微生物無毒，傳質(zhì)性能良好，性質(zhì)穩(wěn)定、不易被生物分解，強度高、壽命長，價格低廉等。對于米根霉的固定化技術(shù)，研究者在選用材料時大多數(shù)使用軟凝膠，如海藻酸鈣等。甲殼糖雜化海藻酸鹽主要用于改善固定材料的機械性能，同時增強菌體的生物活性。Goksungur等用此載體進行固定化發(fā)酵L-乳酸，發(fā)現(xiàn)游離細(xì)胞數(shù)量比單用海藻酸鈣作為載體的減少了很多，同時乳酸產(chǎn)量也相應(yīng)有大幅增加。載體材料對乳酸固定化發(fā)酵的影響第81頁/共205頁（四）提取工藝

溶劑萃取法液膜法提取乳酸離子交換法電滲析法第82頁/共205頁（五）L-乳酸的應(yīng)用

在食品行業(yè)中的應(yīng)用在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用在輕工、化工行業(yè)的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用可生物降解材料聚乳酸第83頁/共205頁第84頁/共205頁第85頁/共205頁（六）研究展望1利用基因工程技術(shù)獲得高產(chǎn)L-乳酸的基因工程菌株。通過基因工程化技術(shù)可以知曉菌種突變株在分子水平上的變化及乳酸產(chǎn)量提高的機制，可以減少一代一代誘變篩選的時間。2控制乳酸產(chǎn)品構(gòu)型。L-乳酸與人體完全融合性及聚L-乳酸的生物降解性，使得L-乳酸的應(yīng)用范圍極為廣泛。因此控制乳酸產(chǎn)品構(gòu)型尤為重要，通過對乳酸構(gòu)型影響因素的詳細(xì)研究可以達(dá)到控制產(chǎn)品構(gòu)型的目的。第86頁/共205頁3研發(fā)新型發(fā)酵設(shè)備，改良提取工藝。設(shè)計新型高效的原位分離反應(yīng)器，以適應(yīng)連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵過程，綜合運用及優(yōu)化集成分子蒸餾及膜技術(shù)等改良提取工藝，以降低成本，提高產(chǎn)品純度。

第87頁/共205頁

4拓展L-乳酸的應(yīng)用領(lǐng)域。加強乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸聚合物、丙烯酸類聚合物等方面的研究，以進一步擴大乳酸的應(yīng)用范圍。5降低乳酸生產(chǎn)成本。綜合利用玉米粉、甘薯粉、馬鈴薯粉等生物質(zhì)原料、可再生資源，提高副產(chǎn)品的經(jīng)濟效益，降低乳酸生產(chǎn)原料的成本。第88頁/共205頁(一）、歷史20世紀(jì)20年代，發(fā)現(xiàn)某些霉菌和酵母可積累L-蘋果酸。60年代，英美用化學(xué)合成法生產(chǎn)L-蘋果酸，成本高。1959年，日本利用短乳桿菌（lactabacillusbrevis）產(chǎn)生的富馬酸酶催化富馬酸轉(zhuǎn)化為L-蘋果酸成功。60年代以來，各國爭相研制一步法從淀粉等糖質(zhì)原料生產(chǎn)蘋果酸。目前，世界上蘋果酸的主要產(chǎn)地是日本。三蘋果酸

第89頁/共205頁

由于L－蘋果酸屬于發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品，安全性能有保障，因此，國際市場上需求量快速增加，近年來需求量保持在年均10%左右的高速度。目前世界蘋果酸主要生產(chǎn)國有美國、加拿大、日本等，世界總產(chǎn)量每年約為10萬噸，其中L－蘋果酸產(chǎn)量每年約為4萬噸，而世界市場潛在需求量達(dá)到每年6萬噸，可見市場發(fā)展空間之大。其中日本是世界主要的L－蘋果酸生產(chǎn)國與出口國，（二）蘋果酸生產(chǎn)現(xiàn)狀第90頁/共205頁（三）蘋果酸的理化性質(zhì)蘋果酸，又名2－羥基丁二酸，由于分子中有一個不對稱碳原子，有兩種立體異構(gòu)體。大自然中，以三種形式存在，即D－蘋果酸、L－蘋果酸和其混合物DL－蘋果酸。白色結(jié)晶體或結(jié)晶狀粉末，有較強的吸濕性，易溶于水、乙醇。有特殊愉快的酸味。蘋果酸主要用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。第91頁/共205頁1.從果汁中直接抽提法：經(jīng)濟上不合理2.化學(xué)合成法：產(chǎn)物是DL-蘋果酸3.發(fā)酵法：（1）一步法糖類蘋果酸（2）二步法根霉酵母菌、細(xì)菌糖類富馬酸蘋果酸4.酶轉(zhuǎn)化法:(常用)固定化細(xì)胞富馬酸（化學(xué)合成）L-蘋果酸富馬酸酶

（四）、生產(chǎn)方法第92頁/共205頁（五）常用菌種1.一步發(fā)酵法：黃曲霉、米曲霉、寄生曲霉；2.兩步發(fā)酵法：華根霉、無根根霉、短乳桿菌、膜畢赤酵母；3.酶轉(zhuǎn)化法：短乳桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、黃色短桿菌。第93頁/共205頁酶轉(zhuǎn)化法:(常用)

固定化細(xì)胞富馬酸鹽（化學(xué)合成）蘋果酸鹽（六）蘋果酸的生產(chǎn)方法（以酶轉(zhuǎn)化法為例）菌種：黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum）第94頁/共205頁1.游離細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化法

8%富馬酸溶液（pH7.5）+2%濕菌體→蘋果酸條件：35℃150r/min24~36h轉(zhuǎn)化率90%以上

2.固定化細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化法

菌種：產(chǎn)氨短桿菌或黃色短桿菌

第95頁/共205頁

方法：包埋法（聚丙烯酰胺凝膠或卡拉膠＋KCl）該方法易生成與蘋果酸難以分離的琥珀酸。因此，細(xì)胞被固定以后必須經(jīng)化學(xué)試劑處理，以防止這種副反應(yīng)的發(fā)生。第96頁/共205頁采用固定化技術(shù)必須注意以下幾個問題：細(xì)胞被固定前富馬酸酶活力要高；使用的固定化方法對酶的損害較??；細(xì)胞被固定后不應(yīng)引起副反應(yīng)的發(fā)生；固定化細(xì)胞應(yīng)有高度的操作穩(wěn)定性。第97頁/共205頁兩種生產(chǎn)方法的比較：原料成本雜質(zhì)發(fā)酵法農(nóng)產(chǎn)品低低酶轉(zhuǎn)化法化工原料高高發(fā)酵法尚未大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的主要原因：菌種的產(chǎn)酸率低。第98頁/共205頁（七）蘋果酸的提取從酶轉(zhuǎn)化液中提取蘋果酸

H2SO4過濾CaCO3流程：轉(zhuǎn)化液→酸解液→濾液→蘋果酸鈣

12.5%

過濾→離子交換→濃縮→結(jié)晶→干燥→蘋果酸

H2SO465%~80%第99頁/共205頁1.選用更合適的原料如葡萄糖、蔗糖、糖蜜、食用級淀粉等進行精細(xì)發(fā)酵；2.在菌體快速絮凝、發(fā)酵液膜分離和凈化技術(shù)方面進行探討；3.研究用離子色譜法、樹脂吸附法、萃取法等提取技術(shù)替代傳統(tǒng)的鈣鹽法；

（八）、L一蘋果酸生產(chǎn)技術(shù)展望第100頁/共205頁四葡萄糖酸

葡萄糖酸是葡萄糖衍生的糖酸,分子式為C6H12O7。為結(jié)晶狀化合物，熔點131℃,呈弱酸性，溶于水，微溶于乙醇。第101頁/共205頁

葡萄糖酸作為蓬松劑、凝固劑、鰲合劑、酸味劑而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、建筑等行業(yè)，葡萄糖酸與鈉、鈣、鋅、亞鐵等金屬氧化物合成制得的葡萄糖酸鹽可作為食品添加劑和營養(yǎng)增補劑添加到食品中。葡萄糖酸的金屬絡(luò)合物在堿性體系中廣泛用作金屬離子的掩蔽劑。葡萄糖酸鈉可分為工業(yè)級，食品級和醫(yī)藥級目前我國市場價格分別在4300-4800/t，7800-8500元／t，8800-10000元／t。第102頁/共205頁

山東凱翔生物化工有限公司專業(yè)從事葡萄糖酸鈉，葡萄糖酸內(nèi)酯，衣康酸的研究、開發(fā)、生產(chǎn)和銷售，擁有先進的生物發(fā)酵設(shè)備、一流的檢測手段、現(xiàn)代化的科學(xué)管理級雄厚的技術(shù)力量，并通過了ISO9001國際質(zhì)量管理體系認(rèn)證、ISO14001國際環(huán)境管理體系認(rèn)證、OHSAS18001國際職業(yè)健康安全管理體系認(rèn)證。公司年產(chǎn)葡萄糖酸鈉35000噸，是國內(nèi)最大的生產(chǎn)供應(yīng)商，生產(chǎn)的“凱翔”牌葡萄糖酸鈉，葡萄糖酸內(nèi)酯各項技術(shù)指標(biāo)均達(dá)到國際先進水平，產(chǎn)品暢銷美洲、歐洲、東南亞、中東等國家和地區(qū)。第103頁/共205頁上?？ú┕べQ(mào)有限公司

山東新華醫(yī)藥集團

山東中舜科技發(fā)展有限公司第104頁/共205頁

葡萄糖酸的發(fā)現(xiàn)1880年Boutroux發(fā)現(xiàn)使用醋化醋桿菌發(fā)酵葡萄糖能夠產(chǎn)生一種不揮發(fā)的酸，后來確定為葡萄糖酸。以后的許多研究者報道了其他幾種細(xì)菌也能夠產(chǎn)生葡萄糖酸和酮基葡萄糖酸。上個世紀(jì)30年代以前，生產(chǎn)葡萄糖酸主要是使用細(xì)菌。1922年，Molliard發(fā)現(xiàn)，利用霉菌也能夠發(fā)酵葡萄糖酸，后來人們知道黑曲霉、米曲霉、文民曲霉和青霉都有氧化葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸的能力。第105頁/共205頁

葡糖糖酸工藝的發(fā)展Bernhager在1924年發(fā)現(xiàn)，采用中和生成酸的方法，黑曲霉能夠高效地將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，而添加碳酸鈣是最好的。在較低溫度，限制氮源的條件下，生成的葡萄糖酸幾乎可以達(dá)到理論產(chǎn)率。第106頁/共205頁1952年，Blom等發(fā)明了添加NaOH、維持pH6．5以上的方法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉，使糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)95％以上，發(fā)酵時間縮短至20小時以內(nèi)，這種工藝形成了現(xiàn)代工業(yè)深層發(fā)酵的基礎(chǔ)。

第107頁/共205頁

1999年,黃道震等以葡萄糖含量為30%的發(fā)酵培養(yǎng)基接種10%的黑曲霉種子液,通氣、220r·min-1，攪拌、流加氫氧化鈉溶液控制pH值6.0～6.5、溫度32～34℃、發(fā)酵20h,殘?zhí)强山抵?g·L-1

以下。

第108頁/共205頁

2002年,Anastassiadis等利用篩選得到的短梗霉(Aureobasidiumpullulans)在連續(xù)式攪拌發(fā)酵罐中進行了靜息細(xì)胞和固定化細(xì)胞的葡萄糖酸連續(xù)轉(zhuǎn)化實驗,葡萄糖酸濃度可達(dá)260g·L-1,最高生成速率為19g·L-1.h-1

。第109頁/共205頁葡萄糖酸發(fā)酵的生物工藝黑曲霉發(fā)酵能力的特性不僅由其遺傳特性決定，其所處的環(huán)境條件也決定了發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸的產(chǎn)量，發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸產(chǎn)量的高低除了受生產(chǎn)菌種的影響外，培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件對產(chǎn)量的影響也很大。黑曲霉發(fā)酵水平的提高，主要依賴于菌種選育及發(fā)酵工藝(培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件)的優(yōu)化，這兩個環(huán)節(jié)是相輔相成的。第110頁/共205頁

菌種選育按照生產(chǎn)要求，根據(jù)微生物的遺傳和變異的理論，用人工的方法造成菌種變異，再經(jīng)過篩選獲得高產(chǎn)變株而達(dá)到提高發(fā)酵水平的目的；第111頁/共205頁

而發(fā)酵工藝的優(yōu)化是改變培養(yǎng)基的在發(fā)酵過程中改變培養(yǎng)溫度、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、調(diào)節(jié)pH等措施，從而強化微生物的生物合成的全過程，提高發(fā)酵產(chǎn)量。通過工藝優(yōu)化，改進發(fā)酵培養(yǎng)基成份和發(fā)酵條件，創(chuàng)造適合菌體生長和生物代謝的最佳條件，充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力，從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量

第112頁/共205頁表1

經(jīng)過紫外線誘變所獲得的突變菌株的葡萄糖氧化酶活性菌株號初篩培養(yǎng)基的藍(lán)色圈直徑（mm）葡萄糖氧化酶（U/g）酶活是出發(fā)菌株的倍數(shù)P-9611.51.00U-15713.91.21U-17517.31.50U-5699.50.83U-691128.72.50U-7858.40.73第113頁/共205頁葡萄糖酸發(fā)酵生產(chǎn)第114頁/共205頁發(fā)酵過程影響葡萄糖酸產(chǎn)量的因素葡萄糖濃度發(fā)酵液PH值溶氧接種量第115頁/共205頁

結(jié)論：(1)葡萄糖含量對黑曲霉產(chǎn)葡萄糖酸沒有抑制作用,但如果葡萄糖含量過高,且用CaCO3

控制pH值時,則發(fā)酵液粘度增大,會嚴(yán)重阻礙發(fā)酵液中氧的溶解和傳遞。較好的葡萄糖控制方式是:總糖含量30%,初糖含量20%,每當(dāng)殘?zhí)墙抵?5%時補加5%的糖。第116頁/共205頁

(2)pH值控制可采取流加30%NaOH溶液、加25%～30%Ca(OH)2

乳濁液、分批添加CaCO33種方式。流加NaOH溶液,發(fā)酵速率快,轉(zhuǎn)化率高,最適合葡萄糖酸鈉的生產(chǎn);流加Ca(OH)2或分批添加CaCO3適合于葡萄糖酸(鈣)、葡萄糖酸內(nèi)酯、葡萄糖酸鹽(鈉鹽除外)的生產(chǎn)。

第117頁/共205頁

(3)通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧含量50%左右,產(chǎn)酸性能好、攪拌能耗低,值得推廣應(yīng)用。

（4）通過控制接種量，黑曲霉合成葡萄糖酸鈣最佳接種量為10％此時產(chǎn)量最高。第118頁/共205頁1、氨基酸構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本分子單元。α碳原子分別以共價鍵連接氫原子、羧基和氨基及側(cè)鏈。側(cè)鏈不同，氨基酸的性質(zhì)不同。目前世界上可用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸有20多種。一、氨基酸簡介第二節(jié)氨基酸

第119頁/共205頁2、氨基酸的用途（1）食品工業(yè)：強化食品：賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中。增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸。甜味劑：苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯，甜味是蔗糖的150-200倍),此產(chǎn)品1981年獲FDA批準(zhǔn),現(xiàn)在每年產(chǎn)量已達(dá)數(shù)萬噸。第120頁/共205頁（2）飼料工業(yè)：甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動物飼料，添加蛋氨酸、賴氨酸、精氨酸等必須氨基酸可促進動物生長發(fā)育、改善肉質(zhì)、節(jié)省蛋白飼料、降低成本等。

第121頁/共205頁

（3）醫(yī)藥工業(yè)：多種復(fù)合氨基酸制劑可通過輸液治療營養(yǎng)或代謝失調(diào)氨基酸注射液由1985年的100萬瓶增長到2003的1.5億萬瓶，每年以15-20%的速度遞增，全行業(yè)的年產(chǎn)值預(yù)計能達(dá)到10億元苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。第122頁/共205頁（4）化學(xué)工業(yè)：谷氨基鈉作洗滌劑.丙氨酸制造丙氨酸纖維（合成高分子化合物）甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸可制表面活性劑、緩沖劑和抗氧劑等第123頁/共205頁表3--8世界氨基酸主要生產(chǎn)廠家生產(chǎn)能力品名廠家生產(chǎn)能力品名廠家生產(chǎn)能力蛋氨酸日本曹達(dá)20000谷氨酸味之素60000蛋氨酸日本住友化學(xué)5000谷氨酸日本旭化成15000蛋氨酸日本化藥2500谷氨酸協(xié)和發(fā)酵15000蛋氨酸德國迪高沙85000谷氨酸日本武田藥品15000蛋氨酸法國AEC105000色氨酸味之素100蛋氨酸美國孟山都45000色氨酸昭和電工200蛋氨酸墨西哥阿爾拜梅克斯5000色氨酸三井東壓100蛋氨酸西班牙Sodeti4000色氨酸田造制藥50蛋氨酸蘇聯(lián)Volgograd4000色氨酸日本化藥50

色氨酸協(xié)和發(fā)酵50賴氨酸日本味之素55000甘氨酸日本有機合成化學(xué)6000賴氨酸日本協(xié)和發(fā)酵20500甘氨酸協(xié)和發(fā)酵5000賴氨酸日本東麗6500甘氨酸日本化藥1000賴氨酸南朝鮮味元10000丙氨酸武藏野化學(xué)研究所——

丙氨酸日本化藥——第124頁/共205頁3、氨基酸生產(chǎn)的歷史氨基酸生產(chǎn)首先從谷氨酸開始19l0年日本味之素公司采用提取法大量生產(chǎn)味精1936年美國從甜菜廢液中提取谷氨酸1956年日本用糖質(zhì)原料發(fā)酵谷氨酸成功，完全取代了原來的水解法。1960年發(fā)酵法生產(chǎn)了賴氨酸，同年用合成法生產(chǎn)dl－蛋氨酸。

第125頁/共205頁

1962年谷氨酸的合成法生產(chǎn)成功1966年采用醋酸原料生產(chǎn)谷氨酸，此后石油發(fā)酵谷氨酸、賴氨酸、酪氨酸等也獲得成功目前氨基酸幾乎都可應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)。第126頁/共205頁我國味精生產(chǎn)始于1923年，上海天廚味精廠最先用水解法生產(chǎn)1932年沈陽開始用脫脂豆粉水解生產(chǎn)味精1964年上海味精廠和有關(guān)科學(xué)研究單位協(xié)作，開始采用發(fā)酵法生產(chǎn)味精，現(xiàn)在全國已普遍采用目前除味精外，還生產(chǎn)賴氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸等十多種氨基酸。第127頁/共205頁生產(chǎn)氨基酸的大國為日本和德國。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸,可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。第128頁/共205頁4、氨基酸的生產(chǎn)方法發(fā)酵法：直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株發(fā)酵。添加前體發(fā)酵法：如用鄰氨基苯甲酸，生產(chǎn)L-色氨酸；甘氨酸生產(chǎn)L-絲氨酸。酶法：利用微生物細(xì)胞或產(chǎn)生的酶來制造氨基酸。延胡索酸和銨鹽為原料，經(jīng)天冬氨酸酶催化生產(chǎn)L-天冬氨酸。第129頁/共205頁提取法：常用毛發(fā)、血粉等蛋白質(zhì)原料水解，從中提取。如胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸合成法：合成法獲得DL-蛋氨酸、不對稱合成法獲得L-氨基酸。如丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學(xué)合成法由于前體物的成本高，工藝復(fù)雜，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。第130頁/共205頁二谷氨酸我國與國外谷氨酸生產(chǎn)的現(xiàn)狀及存在問題菌種的性能：我國產(chǎn)酸8.6－10％，轉(zhuǎn)化率55％；日本10－12％，轉(zhuǎn)化率55％。工藝和過程控制：我國低糖和中糖發(fā)酵，日本高糖發(fā)酵并流加、提高罐壓，保證溶氧。對溫度、壓力、空氣流量、蛋白質(zhì)、溶氧采用計算機控制。第131頁/共205頁（一）、

菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求

斜面菌種一級種子培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)

發(fā)酵罐

1.種子培養(yǎng)過程第132頁/共205頁菌種：鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘變株。生長特點：糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長因子。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)18-24h。一級種子培養(yǎng)：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH6.5-6.8。1000ml三角瓶裝量200－250ml，震蕩，32℃，培養(yǎng)12h。二級種子培養(yǎng)：用種子罐培養(yǎng)，料液量為發(fā)酵灌投料體積的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃進行通氣攪拌7－10h。第133頁/共205頁2、種子質(zhì)量要求一級種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：一級種子為搖瓶種子。質(zhì)量要求：顯微鏡檢查，無雜菌，菌體粗壯、均勻、排列整齊涂平板檢查無雜菌、無噬菌斑OD值凈增0.6左右。種子營養(yǎng)液pH在6.7左右種子營養(yǎng)液殘?zhí)窃?.5%以下。第134頁/共205頁平板檢查無雜菌、無噬菌體污染，菌體大小均一，呈單個或八字排列?；罹鷶?shù)108－109/ml。pH在7.2左右，殘?zhí)呛吭?.5左右。其它各項指標(biāo)與一級種子相同。種齡和種量的控制一級種子控制在11-12h，二級控制在7-8h。種量為1％。過多，菌體嬌嫩，不強壯，提前衰老自溶，后期產(chǎn)酸量不高。二級種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：二級種子為生產(chǎn)車間的種子罐中培養(yǎng)的，質(zhì)量要求第135頁/共205頁（二）、谷氨酸的生產(chǎn)工藝第136頁/共205頁1谷氨酸發(fā)酵工藝流程磷酸鹽、玉米漿、鎂鹽等分過濾器發(fā)酵灌調(diào)和配料預(yù)處理（水解）發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)pH連消菌種罐等電沉淀粗谷氨酸中和搖瓶菌種原料種子培養(yǎng)基空氣斜面尿素貯罐空氣凈化系統(tǒng)脫色結(jié)晶濃縮成品味精第137頁/共205頁2原料的預(yù)處理（1）.淀粉水解糖的制備：酸水解或酶水解酸水解法調(diào)漿：干淀粉用水調(diào)成10-110Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8％至pH1.5。糖化：蒸汽加熱，加壓糖化25min。冷卻至80℃下中和。中和：燒堿中和，至pH4.0-5.0脫色：活性炭脫色和脫色樹脂?；钚蕴坑昧繛?.6-0.8％，在70℃及酸性條件下攪拌后過濾。第138頁/共205頁酶法：以大米或碎米為原料時采用調(diào)漿配料：大米進行浸泡磨漿，將淀粉乳調(diào)成15－20°Bè，用Na2CO3調(diào)pH6.4-6.5，用CaCl2調(diào)節(jié)漿中的Ca2+至50mg/L。加細(xì)菌a-淀粉酶（10－12u/g，干淀粉計算)。噴射液化：一次噴射溫度100－105℃，層流罐維持95－100℃，液化時間1h。典色反應(yīng)棕紅色。液化液經(jīng)二次噴射，維持溫度130－140℃，滅酶5－10min，再經(jīng)板式換熱器冷卻至70℃以下，進入糖化罐。糖化：糖化溫度60±1℃，pH4.0-4.4；糖化酶（100－120u/g，干淀粉計算)糖化過濾：糖液先用Na2CO3水溶液調(diào)pH4.8-5.0，過濾。第139頁/共205頁糖化液的質(zhì)量要求色澤淡黃色透明液糊精反應(yīng)無還原糖含量25－28％DE值95－98％透光率60％pH4.6-5.0淀粉轉(zhuǎn)化率95－98％第140頁/共205頁糖蜜原料：不宜直接用來作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。預(yù)處理方法：活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫60或添加青霉素。第141頁/共205頁3谷氨酸發(fā)酵控制發(fā)酵培養(yǎng)基（1）、碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖低中糖發(fā)酵：初始糖濃度12.5-13%.中高糖發(fā)酵：初始糖濃度14-16%。補糖發(fā)酵：初始糖濃度12-13%，中后期補糖2-4％。目前，較多采用低糖濃度流加發(fā)酵控制。碳源濃度過高時，對菌體生長不利，氨基酸的轉(zhuǎn)化率降低。第142頁/共205頁（2）、氮源：無機氮源:(1)尿素(2)液氨(3)碳酸氫銨；有機氮源:玉米漿、麩皮水解液、豆餅水解液和糖蜜等。尿素滅菌時形成磷酸銨鎂鹽，須單獨滅菌，分批流加。氨水用pH自動控制連續(xù)流加

C:N，谷氨酸發(fā)酵所需比為100：15～21

第143頁/共205頁（3）、無機鹽：磷酸鹽、硫酸鎂、鉀鹽、微量元素磷酸鹽：對發(fā)酵有顯著影響，不足時糖代謝受抑制。控制在0.005-0.01mol/L硫酸鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，促進葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。G＋要求鎂離子濃度最低25ug/L；G-要求4-6ug/L。鉀鹽：鉀鹽多，有利于產(chǎn)酸；鉀鹽少，有利于菌體生長微量元素：主要是錳（許多酶的激活劑）、鐵（細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶活性基團組分，可促進谷氨酸產(chǎn)生菌的生長），10-6－10-4mol/L。嚴(yán)格控制銅、汞含量，以免對發(fā)酵產(chǎn)生毒害作用。第144頁/共205頁（4）、生長因子：參與細(xì)胞膜的代謝，影響膜的透性。A生物素（2－5ug/ml）(2)維生素B1生物素：乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合成，影響磷酯的合成。當(dāng)磷酯含量減少到正常時的一半左右時，細(xì)胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出，積累于發(fā)酵液中。生物素過量，則發(fā)酵過程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，代謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。當(dāng)生物素缺乏時，菌種生長緩慢。因此，一般將生物素控制在亞適量條件下，才能得到高產(chǎn)量的谷氨酸。第145頁/共205頁成分菌種AS-1.299AS-1.542B9D110糖12.512.51015玉米漿0.5～0.70.5～0.70.3磷酸氫二鈉0.170.170.160.35硫酸鎂0.06～0.070.070.06Fe2＋、Mn2＋初尿1.8～2.01.01.03.4流加尿1～1.21.8～2.21.8～2.2pH7.07.06.86.7表

不同生產(chǎn)菌谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方第146頁/共205頁4

谷氨酸發(fā)酵工藝控制(1)、

溫度對谷氨酸發(fā)酵的影響

微生物在一定條件下，都有一個最適的生長溫度范圍。谷氨酸產(chǎn)生菌的最適生長溫度為30～32℃，產(chǎn)生谷氨酸的最適為34～37℃。菌體生長期溫度過高,易造成菌體衰老。生產(chǎn)上表現(xiàn)為OD值增長慢，pH值高，耗糖慢，發(fā)酵周期長，谷氨酸生成少。在發(fā)酵中、后期，菌體生長基本停止，適當(dāng)提高溫度可促進產(chǎn)生谷氨酸。因此根據(jù)菌種特點，溫度采用二級或三級管理。即發(fā)酵前期控制在30-32℃；中、后期34-37℃。第147頁/共205頁菌種AS-1.299617AS-1.542T6-13生長溫度30－32℃30－34℃32－34℃32－36℃發(fā)酵溫度34℃34～36℃34～36℃36～38℃表4—2菌谷氨酸產(chǎn)生菌的培養(yǎng)溫度第148頁/共205頁發(fā)酵階段發(fā)酵前期發(fā)酵中、后期pH控制7.57.2－7.4(2)、pH對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制控制pH方法：流加尿素和氨水流加方式：根據(jù)菌體生長、pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等因素決定控制：（1）菌體生長或耗糖慢時，少量多次流加尿素，避免pH過高（2）菌體生長或耗糖過快時，流加尿素可多些，以抑制菌體生長。（3）發(fā)酵后期，殘?zhí)巧伲咏殴迺r，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困難。（4）氨水對pH影響大，應(yīng)采取連續(xù)流加。第149頁/共205頁(3)、

供氧對谷氨酸發(fā)酵的影響

溶解氧的控制：大小是由通風(fēng)與攪拌兩方面決定的，與攪拌器的型式、直徑大小、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌器在發(fā)酵罐內(nèi)的相對位置因素等有關(guān)。一般攪拌器直徑大，轉(zhuǎn)速快，溶氧系數(shù)大。所以，增大攪拌轉(zhuǎn)速比增加通風(fēng)量對溶氧系數(shù)提高更為顯著。第150頁/共205頁具體操作：

發(fā)酵前期，以低通風(fēng)量為宜；發(fā)酵中、后期，以高通風(fēng)量為好。當(dāng)培養(yǎng)基濃度高、營養(yǎng)豐富、生物素用量大時，應(yīng)采用高通風(fēng)量。當(dāng)菌體生長緩慢、pH偏高時，應(yīng)減少通風(fēng)量，或停止攪拌，以利于長菌。當(dāng)菌體生長快、耗糖快時，應(yīng)提高通風(fēng)量，以抑制生長和滿足合成谷氨酸所必須的足夠能量。

第151頁/共205頁項目發(fā)酵罐容積10m320m350m3攪拌轉(zhuǎn)速（r/min）160140110通風(fēng)比（m3/m3·min）1:0.16～0.171:0.151:0.12具體風(fēng)量：前期1:0.12（V/V)；中期1:0.22-0.26；后期1:0.15-0.18發(fā)酵通風(fēng)量的控制第152頁/共205頁(4)、泡沫的消除

（1）泡沫的形成和性質(zhì)攪拌與通風(fēng)發(fā)酵液中含有蛋白胨、玉米漿、黃豆粉是主要的發(fā)泡劑。發(fā)酵液感染雜菌和噬菌體（2）泡沫對發(fā)酵的影響發(fā)酵灌的裝料系數(shù)減少氧傳遞系數(shù)減少發(fā)酵液逃液，增加染菌機會第153頁/共205頁（3）泡沫的消除（控制）調(diào)整培養(yǎng)基的成分（少加或緩加宜起泡的原材料）；改變某些物理化學(xué)參數(shù)（pH、溫度、通氣和攪拌；改變發(fā)酵工藝）采用機械消泡或消泡劑消泡機械消泡：利用機械振動或壓力變化使泡沫破裂消泡劑：屬表面活性劑，天然油脂（豆油、玉米油）；脂肪酸和酯類；聚醚類（氧化丙烯和氧化乙烯與甘油的聚合物）；硅酮類第154頁/共205頁(5)、發(fā)酵過程主要變化及中間代謝控制

1.適應(yīng)期2.對數(shù)生長期3.轉(zhuǎn)化期4.產(chǎn)酸期谷氨酸的發(fā)酵過程曲線第155頁/共205頁（1）適應(yīng)期：尿素分解出氨使pH上升，糖不利用，2-4h。措施：接種量和發(fā)酵條件控制使適應(yīng)期縮短。（2）對數(shù)生長期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用后pH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定水平。菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形。不產(chǎn)酸。12h。措施：及時供給菌體生長必須的氮源及調(diào)節(jié)pH，維持溫度30-32℃（3）菌體生長停止期：谷氨酸合成。措施：提供必須的氨及pH維持在7.2-7.4。大量通氣，控制溫度34-37℃。（4）發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑?。措施：營養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時，及時放罐。第156頁/共205頁(6)、異常發(fā)酵現(xiàn)象及其處理

常見的異常發(fā)酵現(xiàn)象及其處理方法序異?，F(xiàn)象原因分析

處理方法

10時pH值高(1)初尿過多(2)尿素滅菌溫度過高、時間過長停攪拌，小通風(fēng)，待菌體生長，pH下降后再按正常發(fā)酵進行

2發(fā)酵前期pH值過高

(1)初尿過多

(2)菌種被燒死

(3)種子感染噬菌體

(4)培養(yǎng)基缺乏或抑制菌體生長

(1)按第1項方法處理(2)補種(3)按感染噬菌體處理

(4)根據(jù)情況補料,補種(5)均先停攪拌、小通風(fēng)第157頁/共205頁3菌體生長緩慢或不長

(1)感染噬菌體

(2)培養(yǎng)基貧乏

(3)菌種老化

(4)前期風(fēng)量過大,或初尿過多抑制生長(1)按感染噬菌體處理(2)補料，并停攪拌(3)換種、補種(4)停攪拌、小通風(fēng)4中后期耗糖慢、產(chǎn)酸低

(1)菌種老化

(2)前期風(fēng)量過大后期無力

(3)種子或發(fā)酵前期溫度過高

(4)生物素不足

(1)略減風(fēng)量，如殘?zhí)歉呖裳a種或并罐發(fā)酵

(2)略減風(fēng)量，如殘?zhí)歉呖裳a種或并罐發(fā)酵

(3)略減風(fēng)量，如殘?zhí)歉呖裳a種，或并罐發(fā)酵

(4)補料

514h后OD值繼上升

(1)生物素過量

(2)染菌

(1)提高風(fēng)量，提高溫度(2)按染菌處理第158頁/共205頁6耗糖快，pH偏低,產(chǎn)酸低

(1)培養(yǎng)基豐富，生物素過量

(2)pH低，流尿不及時

(3)通風(fēng)不足,空氣短路,攪拌轉(zhuǎn)速低

(4)感染雜菌

(1)提高風(fēng)量,提高pH(2)及時流尿,提高pH(3)提高風(fēng)量,提高pH(4)按染菌處理

7發(fā)酵液變紅色

生物素充足，風(fēng)量不足提高風(fēng)量8谷氨酸生成后又下跌

(1)pH偏低,NH4+過量,谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣弱０?/p>

(2)大量下跌,可能染菌

(1)及時流尿，提高pH(2)按染菌處理

9泡沫太多

(1)水解糖質(zhì)量不好

(2)染菌

(1)改進水解糖質(zhì)量

(2)按染菌處理

第159頁/共205頁(7)、發(fā)展方向改進發(fā)酵工藝

1.一次高濃度糖發(fā)酵

2.降低發(fā)酵初糖濃度,連續(xù)流加糖發(fā)酵

3.混合碳源發(fā)酵

4.應(yīng)用電子計算機控制和管理發(fā)酵,使發(fā)酵工藝最佳化

5.固定化活細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸

第160頁/共205頁(三）谷氨酸的提取

1、

概

述

將谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵液中積累的L-谷氨酸提取出來，再進一步中和、除鐵、脫色、加工精制成谷氨酸單鈉鹽叫提煉。谷氨酸是發(fā)酵的目的物，